一，免(miǎn)疫(yì)印(yìn)跡(jì)膜的(dí)介(jiè)紹

在Western blotting實驗中，NC膜和PVDF膜是最chang用(yòng)的(dí)兩(liǎng)種(zhǒng)膜(mó)。NC膜(mó)是(shì)特(tè)異(yì)性轉移(yí)介質之(zhī)一(yī)，使用範(fàn)圍十分(fēn)廣泛，也是最(zuì)早(zǎo)用於Western blotting實(shí)驗的膜。PVDF膜是(shì)在(zài)1985年(nián)開發出來的，它(tā)能在比較苛刻的條件下(比如(rú)在(zài)酸性(xìng)或鹼(jiǎn)性條件(jiàn)下，或者在(zài)有(yǒu)機(jī)溶劑存在(zài)時)將(jiāng)蛋白(bái)保(bǎo)留(liú)，因(yīn)此更(gēng)廣泛用(yòng)於(yú)Western blotting實(shí)驗(yàn)中(zhōng)。

二(èr)，作用機理的介紹(shào)

1.  NC膜

NC膜(mó)與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)質之間(jiān)是依靠靜(jìng)電(diàn)作用和(hé)疏(shū)水作用(yòng)相(xiāng)結合的(dí)，NC膜(mó)屬(shǔ)於親水(shuǐ)膜(mó)，使用前(qián)無需進行(háng)預活(huó)化，使用方便，價格(gé)低廉(lián)，對(duì)蛋白質的活性影(yǐng)響小，背景(jǐng)低(dī)；但(dàn)其韌(rèn)性較差，易損(sǔn)壞，從(cóng)而(ér)不(bù)能反復(fù)使用(yòng)，如(rú)果在非(fēi)離子型去(qù)汙(wū)劑(jì)作用下(xià)，結合上的蛋(dàn)白比較容易被洗(xǐ)脫下來。

2.  PVDF膜

PVDF膜與蛋白質(zhì)之(zhī)間(jiān)是依靠疏(shū)水(shuǐ)作(zuò)用(yòng)相(xiāng)結合(hé)的(dí)，與NC膜(mó)相(xiāng)比，PVDF膜(mó)有著ji好(hǎo)的(dí)化(huà)學穩定性和更高(gāo)的機(jī)械強度，適(shì)合反復檢測(cè)（reprobing）和(hé)多次剝離(lí)（stripping）。PVDF膜需要先用(yòng)甲(jiǎ)醇(chún)潤濕後(hòu)才能(néng)被常(cháng)規的轉(zhuǎn)膜液所(suǒ)浸潤(rùn)，轉印(yìn)緩衝(chōng)液(yè)中(zhōng)添(tiān)加(jiā)的Ca2+離(lí)子能(néng)夠(gòu)增強鈣(gài)調(tiáo)蛋(dàn)白與(yǔ)Immobilon®-P轉印(yìn)膜(mó)的(dí)結合，鈣的結合(hé)使(shǐ)蛋白(bái)質分子形成一個(gè)疏水(shuǐ)袋結構(gòu)，從而增(zēng)加蛋白(bái)與膜的結合。此外，PVDF膜(mó)具有更高的蛋白(bái)結(jié)合(hé)能(néng)力，一般(bān)NC膜的結合(hé)能(néng)力是(shì)80-100μg/cm2，而(ér)PVDF膜可(kě)以達(dá)到(dào)150-160μg/cm2。因(yīn)此(cǐ)，PVDF膜(mó)已成為現(xiàn)階段(duàn)實驗室WB的常(cháng)用(yòng)膜(mó)。

三，PVDF膜(mó)使(shǐ)用須(xū)知

1. PVDF膜為什(shí)麼(mó)需(xū)預先活(huó)化？

PVDF膜本質(zhì)上(shàng)是一種疏(shū)水(shuǐ)性的(dí)聚(jù)合(hé)物，不帶電(diàn)荷並具(jù)有(yǒu)疏(shū)水性，不能被常規(guī)轉膜液(yè)所(suǒ)浸潤(rùn)，為了在水(shuǐ)性緩(huǎn)衝液(yè)中(zhōng)使(shǐ)用，需要在(zài)使用前進行預處(chǔ)理以浸潤(rùn)和活化(huà)膜。最(zuì)chang用的(dí)方法是使用(yòng)50%（v/v）或更高濃(nóng)度(dù)的醇（甲(jiǎ)醇(chún)，乙(yǐ)醇和異(yì)丙醇）溶液(yè)進行浸潤和活化(huà)，使(shǐ)得(dé)PVDF膜中微孔(kǒng)內(nèi)的(dí)空氣能(néng)夠被(bèi)低表麵張力(lì)的(dí)甲醇所替代(dài)，從(cóng)而易(yì)於後續緩(huǎn)衝液進入(rù)PVDF膜(mó)中的微(wēi)孔(kǒng)內，使(shǐ)得PVDF膜從(cóng)疏水(shuǐ)性轉變(biàn)為(wéi)親水(shuǐ)性(xìng)，在(zài)浸潤(rùn)過(guò)程中(zhōng)膜的外觀會(huì)從(cóng)不透明轉變(biàn)為半(bàn)透明(míng)，此時表明PVDF膜(mó)已被(bèi)wan全(quán)浸濕。然後用水(shuǐ)反復衝洗(xǐ)以去除醇(chún)類，再直(zhí)接將膜放(fàng)入(rù)轉印(yìn)緩衝(chōng)液中進行平(píng)衡(héng)。膜(mó)被浸濕後，通過電轉移(yí)，蛋(dàn)白(bái)質與膜接(jiē)觸(chù)發生疏(shū)水(shuǐ)作(zuò)用(yòng)而(ér)被(bèi)吸附在PVDF膜上(shàng)。

2. PVDF膜孔(kǒng)徑(jìng)對蛋白(bái)結合的影響？

膜(mó)孔徑(jìng)越小，膜對低(dī)分子(zǐ)量(liáng)的蛋(dàn)白結合(hé)就越(yuè)牢固(gù)。首(shǒu)先(xiān)，較(jiào)小的孔徑(jìng)會限製(zhì)蛋白分子(zǐ)的(dí)運(yùn)動，減(jiǎn)緩(huǎn)其轉(zhuǎn)移(yí)速度(dù)，蛋(dàn)白(bái)與膜的結合就更(gēng)充分，從(cóng)而(ér)更(gēng)容易(yì)被攔截(jié)在(zài)孔道(dào)內；其(qí)次(cì)，較小的(dí)孔徑還能提(tí)供較(jiào)大(dà)的(dí)膜表(biǎo)麵積，從而(ér)提(tí)高(gāo)了蛋白與膜接觸(chù)的機會；此外，較小的孔(kǒng)徑也能提供更高(gāo)的表(biǎo)麵(miàn)密度(dù)，從(cóng)而增加了孔道與溶(róng)液間(jiān)的分子間吸引力(lì)，這種(zhǒng)吸(xī)附方式被(bèi)稱為“毛(máo)細(xì)作(zuò)用(yòng)"。Schweitzer和Kriz在(zài)一(yī)項研究中(zhōng)發現，較(jiào)小(xiǎo)的(dí)孔徑可(kě)以(yǐ)增(zēng)強其(qí)吸附能(néng)力(lì)並提供(gōng)更高的(dí)蛋白密度(dù)，蛋(dàn)白分(fēn)子量越低，蛋白(bái)的(dí)比表麵(miàn)積(jī)越(yuè)大，與(yǔ)膜接(jiē)觸(chù)麵越大越(yuè)充分，結(jié)合就(jiù)更緊密。但是(shì)，如果(guǒ)膜的(dí)孔徑小(xiǎo)於(yú)0.1 μm，那(nà)麼蛋白(bái)的(dí)轉移(yí)就很(hěn)難(nán)進行(háng)下去了，是(shì)因為(wéi)蛋白質(zhì)分子(zǐ)的直徑大約在1-100 nm之(zhī)間。

3. 如何(hé)選(xuǎn)擇(zé)PVDF膜？

一(yī)般(bān)情況下(xià)，分子量(liáng)大於20kD的蛋白應(yīng)選擇(zé)0.45μm的膜(mó)，分子量小於20kD的蛋白應選擇0.2μm的膜。0.2μm的(dí)PVDF膜內部表(biǎo)麵(miàn)積大約是(shì)0.45μm的PVDF膜的三(sān)倍，因此其吸(xī)附能(néng)力更高。總之(zhī)，選(xuǎn)擇(zé)PVDF膜(mó)的(dí)孔徑大(dà)小需(xū)要根(gēn)據樣(yàng)品蛋白的特(tè)性(xìng)和大小(xiǎo)來確(què)定(dìng)，以期(qī)獲得(dé)最佳(jiā)的結合(hé)效果。

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