免疫熒(yíng)光(guāng)技(jì)術是(shì)根據抗(kàng)原抗體反應的(dí)原(yuán)理(lǐ)，先將已知的抗(kàng)原或(huò)抗(kàng)體標(biāo)記(jì)上(shàng)熒光(guāng)素(sù)，製成熒光(guāng)抗(kàng)體，再用(yòng)這(zhè)種熒(yíng)光抗(kàng)體（或抗原(yuán)）作(zuò)為探針(zhēn)檢(jiǎn)測(cè)組織(zhī)或細胞(bāo)內(nèi)的(dí)相應抗(kàng)原(yuán)（或抗體）。那(nà)麼(mó)你知道在(zài)免(miǎn)疫熒光(guāng)（IF）實(shí)驗中(zhōng)會遇到那(nà)些問(wèn)題以及這些問題的解(jiě)決(jué)方(fāng)法(fǎ)嗎？讓我(wǒ)們(mén)一(yī)起(qǐ)來看(kàn)看吧！

問題一：目(mù)標蛋白熒(yíng)光很(hěn)弱，導(dǎo)致(zhì)組(zǔ)間差異不顯著，導致假(jiǎ)陰性結果(guǒ)

解(jiě)決方(fāng)案：出現這種(zhǒng)情況後(hòu)，首先檢查(chá)抗(kàng)體是否正確，是(shì)否適(shì)用(yòng)於預處理的(dí)組織(zhī)。有(yǒu)些(xiē)抗(kàng)體隻適用(yòng)於冰(bīng)凍切片(piàn)，但如果應用(yòng)於石蠟(là)切片，則會(huì)出(chū)現(xiàn)弱標(biāo)記或無標(biāo)記現象(xiàng)。然後(hòu)通(tōng)過文獻(xiàn)了(liǎo)解目的蛋(dàn)白(bái)在組織(zhī)或(huò)細胞中(zhōng)的表達(dá)豐度。此外，如(rú)果抗(kàng)體修(xiū)復不足，抗原(yuán)表(biǎo)位(wèi)未完(wán)quan暴露，也會出現(xiàn)弱(ruò)標記(jì)。例(lì)如，雖然大多數抗體在(zài)酸性環境(jìng)中修(xiū)復，但(dàn)也(yě)有(yǒu)少(shǎo)數(shù)抗(kàng)體需要在鹼(jiǎn)性環境中(zhōng)修復(fù)。建議查看(kàn)抗體(tǐ)說明(míng)書，嚴格(gé)按照其(qí)修(xiū)復條(tiáo)件(jiàn)進(jìn)行實(shí)驗。

問題(tí)二：目(mù)標蛋(dàn)白的熒光過強(qiáng)，甚至形成非特異(yì)性的標記，一些背(bèi)景染色(sè)可能(néng)被誤認為陽性(xìng)區(qū)域，造成(chéng)假陽性(xìng)結果(guǒ)

解決方(fāng)法：適當降低一抗(kàng)或(huò)者(zhě)二(èr)抗的濃(nóng)度，增(zēng)加(jiā)漂洗時(shí)間，一般能(néng)夠(gòu)有所改善

問題三：DAPI 染(rǎn)細(xì)胞核時，加(jiā)入的試(shì)劑太多，造(zào)成(chéng)高(gāo)背景染色

解(jiě)決方法(fǎ)：滴(dī)加的 DAPI 不(bù)要太多，隻需覆(fù)蓋上(shàng)薄薄(báo)的一(yī)層(céng)即可。

問(wèn)題四(sì)：組(zǔ)織切片預處(chǔ)理不(bù)當(dāng)或(huò)采用(yòng)石(shí)蠟切(qiē)片，導致高背景染色(sè)

解決(jué)方(fāng)案：如果(guǒ)組織切片(piàn)，尤其是石蠟切片脫蠟(là)環節(jié)不徹di，也會(huì)造成區域(yù)性的非特(tè)異(yì)性標(biāo)記。建(jiàn)議(yì)脫(tuō)蠟一定要徹di，脫(tuō)蠟(là)前(qián)充(chōng)分烤片也可以幫助脫蠟(là)。實(shí)驗過程(chéng)中，玻(bō)片(piàn)幹燥(zào)了，同(tóng)樣會(huì)造(zào)成(chéng)高(gāo)背景或(huò)大麵積(jī)的非(fēi)特異(yì)性(xìng)標記。漂洗環(huán)節(jié)和(hé)抗(kàng)體(tǐ)孵育環節(jié)最容易出現幹(gān)片現象，尤(yóu)其(qí)是(shì)大批量(liáng)實(shí)驗時(shí)，一(yī)定要注意。使用免疫組(zǔ)化專(zhuān)用筆(bǐ)畫個圈，可以有(yǒu)效(xiào)改善(shàn)。

問(wèn)題(tí)五(wǔ)：采集圖(tú)像過程(chéng)不當(dāng)，導致原始圖(tú)像不(bù)佳，直接影響(xiǎng)後續(xù)半定(dìng)量分(fēn)析

解決(jué)方案：采(cǎi)集圖(tú)像時不要對每一張(zhāng)圖像都(dū)加上(shàng)標(biāo)尺，否則後期采(cǎi)用(yòng) Image J或者(zhě) IPP 進行分析(xī)時，這些(xiē)標尺(chǐ)會(huì)對(duì)結果造(zào)成(chéng)影(yǐng)響。采集圖像時，速度(dù)要(yào)快。如(rú)果(guǒ)激(jī)發光很(hěn)長時間對準(zhǔn)目標(biāo)區域(yù)，此(cǐ)區(qū)域內(nèi)的(dí)熒(yíng)光衰減會極(jí)快因此(cǐ)，目標(biāo)區(qū)域(yù)較小(xiǎo)時，一定要(yào)盡(jìn)量(liáng)快(kuài)速(sù)采(cǎi)集，減(jiǎn)少(shǎo)人為實(shí)驗(yàn)誤(wù)差(chà)。

更多(duō)有關(guān)免(miǎn)疫(yì)熒光（IF）實驗常見(jiàn)問(wèn)題(tí)有哪(nǎ)些，解決方案(àn)有什(shí)麼的內容(róng)，請(qǐng)聯(lián)係天(tiān)津(jīn)益元(yuán)利康生物(wù)科技有(yǒu)限(xiàn)公(gōng)司(sī)：