蛋白(bái)質(zhì)純化是利用基因工程技術將(jiāng)編碼蛋(dàn)白質(zhì)的核酸(suān)序(xù)列導入宿主(zhǔ)細胞，使其(qí)大量(liáng)表(biǎo)達，然(rán)後采用合適的純化方(fāng)法進行(háng)體外(wài)純(chún)化(huà)，以獲得高(gāo)純度(dù)，高活(huó)性(xìng)和高產量的蛋白(bái)質的過(guò)程(chéng)。那(nà)麼你知道蛋白質純(chún)化操(cāo)作(zuò)步(bù)驟(zhòu)嗎(má)？讓我們一起(qǐ)來看(kàn)看吧！

1，構(gòu)建(jiàn)原核表達質粒(lì)：目的(dí)基因PCR，載(zǎi)體(tǐ)酶(méi)切，連(lián)接(jiē)，轉化，挑單克(kè)隆(lóng)送測序(xù)；

2，將(jiāng)構建(jiàn)成(chéng)功的質粒(lì)轉(zhuǎn)化(huà)到(dào)BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑單克隆小搖過夜(yè)；

3，小(xiǎo)誘導摸索最佳誘導(dǎo)條件：將搖(yáo)過夜的菌(jūn)液1:1000接(jiē)種到(dào)3mL LB中，37℃搖4-5h至菌(jūn)液OD600=0.6-0.8，加入(rù)不(bù)同濃度(dù)IPTG（0.1-1mM），不同溫(wēn)度下誘導，隨著(zhuó)溫度(dù)降低，誘導時間(jiān)延(yán)長，如37 ℃ 誘(yòu)導4-5h，30°C誘(yòu)導6h-8h，16°C誘導(dǎo)16-20h，取不同誘導條件下(xià)誘導(dǎo)前和誘導後(hòu)的(dí)菌液(yè)，跑膠(jiāo)，考染(rǎn)，觀察誘導結果；（一般(bān)來說(shuō)，IPTG濃度(dù)越低，誘導溫度(dù)越低，目的蛋(dàn)白(bái)表達(dá)越慢(màn)，越利(lì)於(yú)蛋(dàn)白質的正(zhèng)確(què)折疊從(cóng)而增加其(qí)可溶性，減少包(bāo)涵體(tǐ)的(dí)產生）

4，找到最適(shì)誘導(dǎo)條(tiáo)件後(hòu)，將(jiāng)菌液1:1000接(jiē)種(zhǒng)到2L的LB中，37℃搖(yáo)至(zhì)菌(jūn)液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留(liú)待(dài)跑膠(jiāo)(1)，然(rán)後在(zài)預實驗(yàn)得到(dào)的(dí)合(hé)適的(dí)誘(yòu)導條(tiáo)件(jiàn)下誘導蛋(dàn)白(bái)表達(dá)，吸出20μL菌(jūn)液留待(dài)跑膠(2)；

5，取出誘導後(hòu)的菌液，4000g，4℃離心(xīn)15min；

6，棄上清液，稱(chēng)重，每克(kè)菌加入10mL Lysis buffer（1:100加(jiā)蛋白(bái)酶抑製劑(jì)），重懸(xuán)，冰上放置(zhì)約30min；

7，壓力(lì)破碎(suì)：放(fàng)掉(diào)高壓(yā)均質(zhì)儀中的(dí)酒(jiǔ)精(jīng)，用(yòng)水衝兩遍(biàn)，用Lysis buffer平(píng)衡一遍，加入菌(jūn)液，加(jiā)壓(yā)（壓力(lì)不(bù)要超過(guò)800kpa），菌液過三到(dào)五遍至(zhì)透明(míng)不粘稠(chóu)；

8，收集破碎(suì)後(hòu)的(dí)菌(jūn)液(yè)，12000g，4℃離(lí)心20min，將(jiāng)上(shàng)清和沉(chén)澱(diàn)分離(lí)，各留(liú)取(qǔ)20μL樣(yàng)品(pǐn)(3)(4)待跑膠；

9，將2mL Ni-NTA加入純(chún)化(huà)柱(zhù)，待(dài)乙醇濾(lǜ)過，用水衝(chōng)洗，加入Lysis buffer平(píng)衡柱子；

10，用Lysis buffer將(jiāng)Ni-NTA重懸加入(rù)上(shàng)清中(zhōng)，混(hùn)匀，4℃搖床孵育2h；

11，將(jiāng)上清液4℃過柱(zhù)，收集(jí)濾(lǜ)過液(yè)20μL(5)；

12，用5mL Wash buffer洗(xǐ)柱子3次(cì)，收集(jí)濾(lǜ)過液(yè)樣品20μL(6)；

13，加入1mL Elution buffer，孵(fū)育(yù)5min，收(shōu)集洗脫(tuō)液，重(zhòng)復(fù)5次，收集5mL洗脫(tuō)液於(yú)同一管中，留(liú)取20μL樣(yàng)品(pǐn)(7)；

14，將(jiāng)實驗過程中得(dé)到(dào)的各個(gè)蛋(dàn)白樣(yàng)品(pǐn)跑(pǎo)膠，考馬斯(sī)亮(liàng)藍染(rǎn)色(sè)1h，脫色至背(bèi)景(jǐng)藍(lán)色(sè)較淺，可見(jiàn)清(qīng)晰蛋(dàn)白條帶；

15，分析各(gè)個(gè)樣品的蛋白(bái)條帶(dài)情況，根(gēn)據結(jié)果(guǒ)進行後(hòu)續操(cāo)作：若洗(xǐ)脫蛋白樣(yàng)品中(zhōng)蛋(dàn)白無雜帶(dài)或雜帶少且(qiě)淺(qiǎn)，可(kě)進行透(tòu)析與濃縮，若雜帶多則(zé)需要再次純(chún)化(huà)後進行透(tòu)析(xī)與濃(nóng)縮(suō)。

16，透析：將(jiāng)樣品加入(rù)透析膜(mó)中，兩端(duān)夾緊，4℃透析過夜(yè)；

17，濃縮：根據樣品分子(zǐ)量(liáng)大(dà)小(xiǎo)選(xuǎn)擇(zé)合適的(dí)濃縮管(guǎn)4℃低速濃(nóng)縮(suō)，濃縮後測(cè)蛋白(bái)濃(nóng)度，分(fēn)裝標(biāo)記(jì)，在(zài)液氮(dàn)中速凍，然後凍存於(yú)-80℃冰箱(xiāng)。

更多有(yǒu)關蛋白質純化操作步(bù)驟的(dí)問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)係天津(jīn)益元利康生物科(kē)技(jì)有(yǒu)限公(gōng)司：