免疫(yì)組(zǔ)化技術(shù)是(shì)利(lì)用已(yǐ)知(zhī)的特(tè)異性(xìng)抗(kàng)體(tǐ)或抗(kàng)原(yuán)能特異(yì)性(xìng)結合的(dí)特(tè)點，通(tōng)過(guò)化(huà)學(xué)反(fǎn)應使(shǐ)標記(jì)於(yú)結(jié)合(hé)後的(dí)特(tè)異性抗體上(shàng)的(dí)顯示劑通過(guò)借助顯(xiǎn)微鏡的觀察，從而在抗原抗體(tǐ)結合(hé)部位確(què)定(dìng)組織細(xì)胞結構的一(yī)門組化(huà)技(jì)術(shù)。那(nà)麼影(yǐng)響(xiǎng)免疫組(zǔ)化(huà)實驗(yàn)結果(guǒ)的因(yīn)素有哪些呢？讓我們一起(qǐ)來看看(kàn)吧(bā)！

一，組(zǔ)織(zhī)的固(gù)定(dìng)

組織固定(dìng)的好(hǎo)壞直(zhí)接影(yǐng)響免疫組化的(dí)結果，選擇(zé)良(liáng)好(hǎo)的固定(dìng)液並及時充分(fēn)的(dí)固(gù)定(dìng)可(kě)以(yǐ)防止(zhǐ)組(zǔ)織自(zì)溶，最大限(xiàn)度保(bǎo)留(liú)組織的抗原性，保(bǎo)證免疫組(zǔ)化結果的準確性(xìng)。

常用(yòng)固定液(yè)：

10%的中(zhōng)性(xìng)緩(huǎn)衝(chōng)福(fú)爾馬(mǎ)林(lín)（40%甲醛10ml+0.01mol/LPBS90ml(pH7.4)），一(yī)般固(gù)定液(yè)的量為組(zǔ)織(zhī)塊體積(jī)的4~10倍，固定時間（常溫條件(jiàn)下固定8~24h）。

二(èr)，組織的脫水(shuǐ)

組(zǔ)織脫水不che底(dǐ)，會(huì)出現組(zǔ)織掉片的(dí)現象，而且(qiě)顯色效果差(chà)，容易混(hùn)淆診斷。

為(wéi)保(bǎo)證(zhèng)組(zǔ)織脫水che底(dǐ)，應(yīng)製定(dìng)相應的更換試劑的(dí)製(zhì)度(dù)，及(jí)時(shí)更(gēng)換並有專人負(fù)責(zé)，做好(hǎo)相(xiāng)應(yīng)的(dí)記(jì)錄。

三，切片

玻片選擇粘(nián)附載玻(bō)片，切片不(bù)宜(yí)厚，推薦(jiàn)厚(hòu)度3~5μm，可(kě)以保證後續修(xiū)復時(shí)最大限(xiàn)度暴露抗原。切(qiē)片無皺褶，無(wú)氣(qì)泡，烤片(piàn)溫(wēn)度(dù)設(shè)置(zhì)65~68℃，時間(jiān)為3小(xiǎo)時。烤(kǎo)片(piàn)不充(chōng)分會導(dǎo)致組(zǔ)織(zhī)脫片影響(xiǎng)後續(xù)的檢(jiǎn)測(cè)，但(dàn)烤片也不宜(yí)過度，溫(wēn)度(dù)過(guò)高(gāo)會(huì)加速(sù)抗(kàng)原氧化(huà)，導致抗(kàng)原丟失。

四，阻(zǔ)斷(duàn)內(nèi)源酶

進行免(miǎn)疫(yì)組化(huà)標記(jì)的(dí)組織，通(tōng)常(cháng)含(hán)有一(yī)定(dìng)量的內(nèi)源(yuán)性(xìng)酶，由(yóu)於在免疫組(zǔ)化染色(sè)過程(chéng)中(zhōng)，大部分(fēn)抗體(tǐ)是用(yòng)過(guò)氧化(huà)物酶來標(biāo)記(jì)的。

比如我們通(tōng)常使用HRP即(jí)辣根(gēn)過(guò)氧化(huà)物酶(méi)標記的(dí)二(èr)抗(kàng)，酶起(qǐ)催化(huà)作(zuò)用，促(cù)進(jìn)底(dǐ)物(wù)的結合(hé)，而組(zǔ)織中的內(nèi)源性(xìng)酶(méi)同樣(yàng)也(yě)能催化(huà)底物(wù)，這(zhè)就影(yǐng)響(xiǎng)了免(miǎn)疫組(zǔ)化的特異性(xìng)。所以在加酶標(biāo)二(èr)抗之前(qián)，應先(xiān)用(yòng)*阻斷(duàn)內源酶，將(jiāng)對後(hòu)續(xù)檢測結果的(dí)影(yǐng)響降(jiàng)到zui低。

五，抗體(tǐ)的選擇和使(shǐ)用(yòng)

選用(yòng)與(yǔ)使用的(dí)一抗(kàng)同(tóng)源性的(dí)二(èr)抗(kàng)。要選擇(zé)適(shì)宜(yí)的一(yī)抗，不同(tóng)的(dí)二抗(kàng)與一(yī)抗濃(nóng)度不匹配，都(dū)不能(néng)得到(dào)滿意的結果。

在(zài)滴(dī)加一(yī)抗，二(èr)抗時要(yào)先(xiān)輕(qīng)輕傾(qīng)去PBS液，選用韌性好(hǎo)，吸(xī)水(shuǐ)性(xìng)強的(dí)紙(zhǐ)巾吸幹(gān)組織周圍液(yè)體，輕壓(yā)組(zǔ)織麵吸幹(gān)組(zǔ)織(zhī)表(biǎo)麵水分(fēn)(不(bù)能(néng)滑動)，防止(zhǐ)試(shì)劑(jì)被稀(xī)釋或致濃(nóng)度不均，立(lì)即(jí)滴加(jiā)適(shì)量試(shì)劑，用(yòng)細玻(bō)棒將試劑(jì)擴展至組織(zhī)外1～2mm，防止(zhǐ)出現邊緣(yuán)效應，不能觸(chù)碰(pèng)組織，液麵厚約1mm為宜。

一抗孵育溫度一般設置(zhì)37℃1小時或者(zhě)4℃冰(bīng)箱孵育(yù)過夜(yè)，二抗室溫孵(fū)育(yù)30-60min。為保證實驗結果(guǒ)的(dí)可靠性，推薦在(zài)實驗中(zhōng)設(shè)置(zhì)同片的(dí)陽(yáng)性(xìng)對(duì)照和陰性(xìng)對照(zhào)。

試劑表(biǎo)麵(miàn)的(dí)氣(qì)泡用(yòng)玻棒點(diǎn)破，否則(zé)氣(qì)泡張力作用(yòng)會導(dǎo)致局(jú)部(bù)無試劑，出現(xiàn)氣泡(pào)下(xià)假(jiǎ)陰性反應。

六，顯色(sè)反(fǎn)應

DAB顯色劑(jì)須現(xiàn)配現用，切片多時(shí)應(yīng)分次配製，分批顯(xiǎn)色。根(gēn)據溫(wēn)度和整(zhěng)體顯(xiǎn)色情(qíng)況決定終止(zhǐ)反(fǎn)應(yīng)，一(yī)般顯(xiǎn)色(sè)時(shí)間(jiān)3～5min，時間過(guò)長(cháng)致顯色過(guò)深(shēn)和(hé)背(bèi)景(jǐng)著色(sè)，過(guò)短(duǎn)致反(fǎn)應(yīng)不足(zú)或出現假(jiǎ)陰(yīn)性(xìng)。

由(yóu)於(yú)DAB有一(yī)定的毒性，在操(cāo)作時(shí)要特(tè)別注意自身的防護(hù)，實驗器(qì)材(cái)專用(yòng)，以(yǐ)防汙染。

七，試劑的保存

因(yīn)為抗體(tǐ)是蛋白(bái)質，保存或使用不當不但會造(zào)成浪費，而且(qiě)變質(zhì)會出(chū)現(xiàn)假陰性結果(guǒ)。

要注意(yì)抗(kàng)體的有效期(qī)，對於一次用不完的(dí)抗(kàng)體(tǐ)可保存在冰箱(xiāng)內(nèi)，而不要放(fàng)在冷(lěng)凍室(shì)，反(fǎn)復凍(dòng)融，抗(kàng)體效(xiào)價會(huì)急(jí)劇下降(jiàng)而失(shī)效(xiào)。

同(tóng)時防止抗體的(dí)相(xiāng)互交叉汙染和細(xì)菌(jūn)汙(wū)染。

更(gēng)多有關(guān)免(miǎn)疫(yì)組(zǔ)化實(shí)驗的影(yǐng)響(xiǎng)因(yīn)素，請聯(lián)係天津(jīn)益元利(lì)康生(shēng)物(wù)科技(jì)有限公司：