RNA 是一(yī)種核酸(suān)分(fēn)子，在生物學(xué)中扮(bàn)演著(zhuó)重(zhòng)要的角色
。在(zài)細胞內(nèi)，RNA 不僅具有(yǒu)轉錄和翻(fān)譯的功能，而(ér)且在調(tiáo)控(kòng)基因(yīn)表達，細胞信號傳(chuán)導以及(jí)病(bìng)理機(jī)製等(děng)方(fāng)麵(miàn)也(yě)發(fā)揮(huī)著重(zhòng)要(yào)的(dí)作(zuò)用(yòng)
。Trizol法是目(mù)前(qián)普(pǔ)遍(biàn)使(shǐ)用(yòng)的RNA提取方法(fǎ)，那麼Trizol法提取(qǔ)RNA的(dí)原理與(yǔ)步驟(zhòu)是什(shí)麼(mó)？讓我們一(yī)起(qǐ)來看(kàn)看吧！

一，Trizol法的(dí)實驗原理(lǐ)

TRIZOL 試(shì)劑是(shì)直(zhí)接從細胞或組(zǔ)織(zhī)中提(tí)取總RNA的試劑，它在破碎和溶解(jiě)細(xì)胞(bāo)時能保持 RNA 的完整性
。試劑(jì)主要(yào)成分(fēn)為異(yì)硫氰(qíng)酸和苯(běn)酚，其(qí)中異(yì)硫氰(qíng)酸肌(jī)可(kě)裂(liè)解細胞，促使核(hé)蛋(dàn)白體(tǐ)的解離，使 RNA 與蛋(dàn)白質分離(lí)，並將(jiāng) RNA 釋(shì)放到濟液中(zhōng)
。加入氯仿後離心(xīn)，樣(yàng)品分(fēn)成水樣(yàng)層(無色(sè))和(hé)有(yǒu)機層(黃色)
。RNA 存在(zài)於(yú)水樣層(céng)中
。收集(jí)上麵的水樣層後(hòu)，RNA 可以通(tōng)過異丙醇沉澱來還(huán)原
。在(zài)除(chú)去水(shuǐ)樣(yàng)層(céng)後(hòu)，樣品中的(dí) DNA 和(hé)蛋白也(yě)能(néng)相繼以沉(chén)澱的方(fāng)式還原
。乙(yǐ)醇沉澱能析出(chū)中(zhōng)間層(céng)的 DNA，在有機層中(zhōng)加入(rù)異丙(bǐng)醇能沉(chén)澱出(chū)蛋白(bái)
。

二(èr)，Trizol法提(tí)取RNA操作步驟(zhòu)

1. 匀(yún)漿並(bìng)裂解(jiě)樣本

組(zǔ)織樣本(běn)：每10~100mg組織加入(rù)1ml TRNsol，建(jiàn)議使(shǐ)用機(jī)械匀漿(jiāng)器來匀(yún)漿
。另外也可 用液(yè)氮(dàn)來(lái)破碎組(zǔ)織(zhī)，用研(yán)缽，研杵(chǔ)把(bǎ)組織粉碎後，把粉(fěn)末轉移至一幹(gān)淨的1.5ml小離(lí)心(xīn)管中，在15- 30°C放置5分(fēn)鐘(zhōng)，以(yǐ)che底分離核蛋白(bái)復(fù)合體(tǐ)
。
。樣(yàng)本的體(tǐ)積應不超(chāo)過(guò)所使用的(dí)TRNsol的(dí)體(tǐ)積的10%，否則(zé)會出現(xiàn)DNA汙染(rǎn)
。

2. 相分離(lí)

每(měi)1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯(lǜ)仿(fǎng)
。蓋上(shàng)離(lí)心管(guǎn)蓋(gài)子(zǐ)，劇烈(liè)地(dì)振蕩15sec，在冰上(shàng)孵(fū)育(yù)5 min
。室溫 下，12,000×g下(xià)離心10min
。此時混(hùn)合(hé)物(wù)分成(chéng)三(sān)層：底層(céng)為苯(běn)酚氯仿(fǎng)相層（紅色），中間層(céng)，和上層水相(xiāng)層（無色(sè)）
。水相(xiāng)占總TRIZOL的(dí)60%，RNAwan全(quán)存在於水(shuǐ)相中
。

3. RNA沉(chén)澱

轉移不多於(yú)80%上層水相至(zhì)新(xīn)的離心管中，往(wǎng)水相中加(jiā)入(rù)異丙醇(chún)，每(měi)使用1ml的(dí)TRNsol，加入(rù) 500μl的異丙(bǐng)醇(chún)(注：如(rú)果是(shì)含多糖(táng)，多酚(fēn)的(dí)植物樣(yàng)品，請加入(rù)300μl異(yì)丙醇(chún)的同時加入300μl 0.8M 檸檬(méng)酸(suān)鈉/1.2M NaCl混(hùn)合液)
。渦旋混匀(yún)，室溫下放(fàng)置10min，然後(hòu)在(zài)4度下12,000×g離(lí)心10min，離(lí)心(xīn)前(qián)可(kě)以(yǐ)在管(guǎn)的(dí)側(cè)壁和(hé)底(dǐ)部(bù)看(kàn)到絮狀(zhuàng)膠樣(yàng)沉(chén)澱，這就是RNA沉澱(diàn)
。糖類豐富(fù)的(dí)樣本：富含(hán)多糖的(dí)植物(wù)樣(yàng)本(běn)或(huò)富含糖胺(àn)聚(jù)糖和蛋(dàn)白(bái)質聚糖(táng)的動(dòng)物樣本需要使(shǐ)用(yòng)以(yǐ)下的 修(xiū)飾的(dí)沉(chén)澱方(fāng)法來獲得(dé)純的(dí)RNA
。準備1份(fèn)Buffer A（1.2M NaCl，0.8M檸檬(méng)酸鈉(nà)）
。做(zuò)完(wán)第二(èr)步後， 緊(jǐn)接著(zhuó)依次往(wǎng)水(shuǐ)相中加(jiā)入異(yì)丙醇(chún)和(hé)Buffer A （1ml TRNsol加(jiā)0.3ml的異(yì)丙醇和0.3ml的Buffer A）
。旋渦混匀(yún)，並(bìng)在(zài)室溫(wēn)下,≤12,000×g離(lí)心(xīn)10min，這一(yī)高鹽(yán)沉澱(diàn)會減少(shǎo)復雜(zá)糖類(lèi)的共同(tóng)純化
。

4. RNA洗滌

洗(xǐ)滌RNA:棄上(shàng)清， 並用(yòng)75%乙(yǐ)醇(chún)洗滌(dí)沉澱(diàn)一次(cì)
。旋渦混和(hé)樣本(běn)，並在室溫(wēn)下以不超(chāo)過7,500×g 的速度(dù)離(lí)心樣本5min
。注意(yì)：75％的乙(yǐ)醇必須用(yòng)DEPC處理過的滅(miè)菌水(shuǐ)來(lái)配(pèi)製，否則75％乙(yǐ)醇(chún)中 殘留(liú)的RNaseA會(huì)降(jiàng)解RNA
。5. RNA的溶解:小(xiǎo)心(xīn)地(dì)吸棄乙(yǐ)醇，短暫離心將溶滴甩到(dào)管(guǎn)底(dǐ)，用(yòng)移液槍(qiāng)小(xiǎo)心吸(xī)棄(qì)殘留(liú)的溶(róng)液(yè)
。室 溫下空(kōng)氣(qì)幹(gān)燥RNA 5-10min
。不(bù)要用離(lí)心(xīn)幹燥(zào)裝置或真空(kōng)幹燥(zào)裝(zhuāng)置，因為過度幹燥會(huì)導致(zhì)很難(nán)用 水重(zhòng)新溶解RNA
。加入適當的(dí)DEPC水溶解(jiě)RNA
。

5. RNA再溶(róng)解

去上清，置真(zhēn)空(kōng)或(huò)空氣中5-10分鐘(zhōng)，幹燥RNA沉澱，（不(bù)能(néng)在真(zhēn)空中離(lí)心幹燥）
。注意(yì)不(bù)能將(jiāng)RNA沉(chén)澱(diàn)wan全幹燥(zào)，這(zhè)樣(yàng)會極大地(dì)降低它的(dí)溶(róng)解度(dù)
。部份(fèn)溶解的RNA樣(yàng)品其A260/280 ratio < 1.6
。

用無(wú)RNase 水(shuǐ)或0.5% SDS溶(róng)液(yè)重懸RNA沉澱，用槍(qiāng)頭反復吹打幾(jī)次，靜置10分(fēn)鐘，55-60°C
。測濃度(dù)後-20°C保(bǎo)存(cún)
。

6. 測濃度

 取2μl 儲存(cún)液(yè)加入另(lìng)一個(gè)EP管中，再(zài)加(jiā)入98μl無RNase水，離(lí)心混匀(yún)，以無(wú)RNase水(shuǐ)作空(kōng)白對照(zhào)，測OD260/280值
。1OD=40μg RNA
。OD260/280值(zhí)在1.8-2.0視為純度很高
。一(yī)般(bān)濃在(zài)1000ng/ml較(jiào)準
。濃(nóng)度(dù)太(tài)高要(yào)稀(xī)釋(shì)以後再測(cè)定(dìng)
。

7. RNA鑒(jiàn)定(dìng)

甲醛變性瓊脂(zhī)糖電泳，確(què)定抽提RNA完(wán)整性和(hé)DNA汙(wū)染情況(kuàng)
。

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