ELISA運用了(liǎo)免(miǎn)疫學原(yuán)理和化(huà)學反(fǎn)應(yīng)顯(xiǎn)色原理，需要將抗原或(huò)抗體(tǐ)預(yù)包(bāo)被(bèi)在固相載(zǎi)體(tǐ)表麵，使(shǐ)後來(lái)形成(chéng)的抗原(yuán)-抗體-酶（熒光基團(tuán)）-底物復(fù)合物黏附在載體上(shàng)，通過檢(jiǎn)測(cè)OD值(zhí)或(huò)發(fā)光(guāng)值，來檢測(cè)靶(bǎ)蛋(dàn)白(bái)的(dí)含量。ELISA適合用於(yú)定(dìng)量(liáng)檢測胞(bāo)外的分泌(mì)性(xìng)蛋(dàn)白(bái)，檢測(cè)大(dà)分(fēn)子(zǐ)抗原(yuán)和特異性(xìng)抗體等。那(nà)麼ELISA實驗(yàn)結(jié)果(guǒ)異(yì)常的因素有哪些(xiē)呢？讓我(wǒ)們(mén)一(yī)起來看看吧(bā)！

一，樣品

樣品是(shì)檢(jiǎn)測(cè)的(dí)前提(tí)，樣品(pǐn)質量(liáng)會直接影響(xiǎng)實驗(yàn)結果。可以(yǐ)用ELISA來(lái)檢測的樣品(pǐn)很(hěn)多，根據檢(jiǎn)測(cè)項(xiàng)目不同可以是血清，血(xiě)漿(jiāng)，唾液，尿液等(děng)，但大部分還是(shì)以血(xiě)清為(wéi)樣(yàng)品。作為血清(qīng)樣品，應(yīng)避(bì)免(miǎn)溶血(xiě)，溶血可(kě)能(néng)會(huì)增(zēng)加非特異性(xìng)顯色(sè)，導致(zhì)結果(guǒ)出(chū)現(xiàn)誤差。

血清樣(yàng)品的(dí)反復(fù)凍(dòng)融會使血(xiě)清中的(dí)抗體(tǐ)效價(jià)下(xià)降(jiàng)，所(suǒ)以(yǐ)需(xū)要(yào)多(duō)次(cì)檢(jiǎn)測(cè)的血清樣品，如(rú)在5d內檢(jiǎn)測完，可4℃保存(cún)，如(rú)需(xū)長(cháng)時間(jiān)檢測(cè)，可(kě)進行分(fēn)裝凍存。樣品(pǐn)如被細(xì)菌汙染腐(fǔ)敗，可能(néng)會(huì)導(dǎo)致(zhì)假(jiǎ)陽性(xìng)。

二，溫度

溫度(dù)主(zhǔ)要(yào)影(yǐng)響抗原(yuán)抗(kàng)體反(fǎn)應，酶(méi)促(cù)反(fǎn)應(yīng)速度及非特(tè)異性(xìng)吸附，溫度升(shēng)高(gāo)可使(shǐ)抗原(yuán)抗體(tǐ)結(jié)合反應加(jiā)速(sù)，但(dàn)也(yě)易引起抗(kàng)原(yuán)抗(kàng)體復合(hé)物(wù)的解離(lí)。酶(méi)促反(fǎn)應速度(dù)同(tóng)樣隨溫度升高而(ér)增快，但是酶蛋白變性(xìng)也(yě)加(jiā)快(kuài)，喪失酶(méi)學活(huó)性，降低酶的(dí)有效濃(nóng)度而減慢(màn)反(fǎn)應速(sù)度(dù)，溫度(dù)低(dī)時以前者(zhě)為主(zhǔ)，高時以後(hòu)者為主(zhǔ)。

溫度(dù)是質量控(kòng)製的一(yī)個重(zhòng)要方麵，一般允(yǔn)許±1℃的誤(wù)差(chà)。最(zuì)好水(shuǐ)浴(yù)，微(wēi)孔(kǒng)板浮在水麵，使溫度(dù)迅速(sù)平衡(héng)。如(rú)放(fàng)溫(wēn)箱內溫育，微孔板(bǎn)不應疊(dié)置，為(wéi)避免蒸發(fā)，板(bǎn)上應加蓋，盛放微(wēi)孔(kǒng)板的(dí)濕盒應(yīng)是金(jīn)屬的，傳熱容(róng)易(yì)。空濕(shī)盒(hé)應預先(xiān)放在溫箱(xiāng)中(zhōng)，以平衡溫(wēn)度，在室(shì)溫較(jiào)低時更需要。

三，時間

在溫(wēn)度保(bǎo)證(zhèng)的(dí)前提(tí)下(xià)，時間(jiān)的控(kòng)製(zhì)至關重(zhòng)要，尤(yóu)其(qí)是底(dǐ)物(wù)顯色的時(shí)間控製(zhì)，顯色時(shí)間(jiān)不(bù)足或過(guò)長會(huì)導致實(shí)驗不成立(lì)，無法對檢(jiǎn)測結(jié)果進行(háng)判斷(duàn)。

加人標本，試(shì)劑(jì)及混合的(dí)時間(jiān)稱為(wéi)操作時差。操作(zuò)時(shí)差在每個試驗中(zhōng)都(dū)存(cún)在，對(duì)結果或多或少(shǎo)有影(yǐng)響(xiǎng)。對手工(gōng)操作，尤(yóu)其是樣(yàng)品量大(dà)的項(xiàng)目，從加(jiā)人(rén)第一(yī)個(gè)標(biāo)本(běn)到最後一(yī)個(gè)標本，需幾(jī)十分(fēn)鐘，加人(rén)試(shì)劑及混匀存(cún)在很(hěn)大(dà)的(dí)時間差異，使抗原抗體和酶(méi)促(cù)反應時(shí)間(jiān)不(bù)一(yī)致，易(yì)產生假陽性(xìng)，假(jiǎ)陰性結果。

因(yīn)此(cǐ)，樣(yàng)品過多時，請選(xuǎn)擇分(fēn)批操(cāo)作，對勿須(xū)更(gēng)換(huàn)移液口吸嘴的酶結(jié)合(hé)物(wù)，底(dǐ)物的加樣可(kě)選擇8聯或12聯專用的(dí)多道(dào)加液器(qì)。亦可避免(miǎn)單孔(kǒng)滴加(jiā)底物(wù)時遺漏多加。

四，設(shè)備

儀器(qì)設(shè)備(bèi)是(shì)ELISA實驗(yàn)的(dí)基(jī)礎，常(cháng)用的相(xiāng)關(guān)儀(yí)器設(shè)備(bèi)包括移液器，酶(méi)標儀，洗(xǐ)板機(jī)和恒(héng)溫(wēn)箱(xiāng)等(děng)。所有設(shè)備(bèi)都需要進行檢驗校(xiào)準，保證準(zhǔn)確性和精(jīng)確(què)度。

移(yí)液(yè)器的使用要(yào)盡可能選(xuǎn)擇所需(xū)加液(yè)量(liáng)接近最大(dà)量程，並正(zhèng)確使用，減少實驗(yàn)誤(wù)差(chà)。

酶標(biāo)儀(yí)要(yào)提前開(kāi)機預(yù)熱，保證(zhèng)光(guāng)源(yuán)穩定；洗板機要(yào)檢查加液(yè)孔是否(fǒu)通暢，保(bǎo)證加(jiā)液量(liáng)。

恒溫(wēn)箱要(yào)提(tí)前(qián)開(kāi)機(jī)，開，關門要快速，保(bǎo)證反(fǎn)應溫(wēn)度(dù)。

五，顯色

顯(xiǎn)色(sè)是ELISA中(zhōng)的(dí)最(zuì)後一(yī)步反應(yīng),此時酶催(cuī)化無色的底物生(shēng)成(chéng)有(yǒu)色的(dí)產(chǎn)物(wù)。反(fǎn)應(yīng)的溫(wēn)度和時間(jiān)仍(réng)是影響顯(xiǎn)色(sè)的(dí)因(yīn)素。在一(yī)定(dìng)時間內,陰性孔可保持(chí)無色,而(ér)陽性孔(kǒng)則隨(suí)時間的延(yán)長而呈(chéng)色加(jiā)強(qiáng)。適(shì)當提高溫(wēn)度(dù)有助(zhù)於加(jiā)速顯色進行。

在定量(liáng)測(cè)定(dìng)中,加(jiā)入(rù)底物後的反應溫度(dù)和(hé)時(shí)間應按規(guī)定力求準確。定(dìng)性(xìng)測定的顯(xiǎn)色可(kě)在(zài)室溫(wēn)進(jìn)行,時間一般不(bù)需要(yào)嚴格(gé)控製,有(yǒu)時(shí)可根據(jù)陽性(xìng)對照(zhào)孔(kǒng)和陰(yīn)性(xìng)對(duì)照孔的顯(xiǎn)色(sè)情況(kuàng)適當(dāng)縮(suō)短(duǎn)或(huò)延。

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