WB實(shí)驗(yàn)是分子生(shēng)物(wù)學中(zhōng)最為(wéi)常(cháng)見(jiàn)的(dí)實驗(yàn)，那(nà)麼(mó)你(nǐ)知(zhī)道(dào)影響WB實驗的因(yīn)素有什麼嗎(má)？讓(ràng)我們一(yī)起來(lái)看(kàn)看吧！

一，蛋白樣(yàng)本製(zhì)備

1. 蛋白(bái)質的(dí)樣品(pǐn)製(zhì)備注意以下問(wèn)題：

（1）在(zài)合適的(dí)條件下(xià)，保(bǎo)持蛋(dàn)白(bái)質(zhì)的(dí)最大溶(róng)解性和(hé)可重復(fù)性。

（2）選擇合適(shì)的表麵(miàn)活性(xìng)劑和還原劑(jì)，使其(qí)形成各自多肽的溶(róng)液。

（3）盡量(liáng)去除核(hé)酸，多糖，脂類等分子的幹擾，裂(liè)解(jiě)完畢離(lí)心(xīn)之後(hòu)取中(zhōng)層澄清(qīng)溶液時避免吸到(dào)底層(céng)沉澱(diàn)和(hé)上(shàng)層脂(zhī)類。

（4）整個製(zhì)作(zuò)蛋(dàn)白(bái)樣本的製備(bèi)過程必(bì)須在低溫(wēn)下進行，避免細胞(bāo)破碎釋(shì)放出各種酶類(lèi)，但(dàn)是注意(yì)不(bù)要反復凍融(róng)。

（5）所抽(chōu)取樣品(pǐn)的(dí)蛋(dàn)白(bái)含(hán)量，蛋白變性是(shì)否(fǒu)充(chōng)分等等，還(huán)有，蛋(dàn)白(bái)樣(yàng)品(pǐn)的pH值是(shì)否在(zài)7~8之間(jiān)。這(zhè)會(huì)直(zhí)接影(yǐng)響到(dào)樣品(pǐn)濃縮的效(xiào)果。此(cǐ)外(wài)，蛋(dàn)白樣(yàng)品是否(fǒu)降(jiàng)解(jiě)，目(mù)的蛋白是否(fǒu)已抽取充(chōng)分都(dū)會對最終結果的可靠(kào)性有(yǒu)影響。

2. 小分子量蛋(dàn)白10KD需要的(dí)注(zhù)意(yì)點

（1）可(kě)選擇孔徑0.22μm的(dí)PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜(mó)時間(jiān)縮短(duǎn)，另外可采(cǎi)用(yòng)Tricine-SDS-PAGE體係；

（2）也可以選擇(zé)PSQ膜，同(tóng)時縮短轉移(yí)時間。也(yě)可以將兩張(zhāng)膜疊在(zài)一起，再轉(zhuǎn)移(yí)，其(qí)他按步驟(zhòu)即(jí)可。

3. 大分子量蛋(dàn)白200KD需(xū)要的(dí)注意點(diǎn)：

（1）做200kd蛋白(bái)的WB時(shí)要(yào)注意，分(fēn)離膠(jiāo)最(zuì)好(hǎo)選擇(zé)>7%的(dí)；剝膠(jiāo)時要(yào)小(xiǎo)心；

（2）轉移(yí)時(shí)間需(xū)要相應延長；要(yào)做分子(zǐ)量參(cān)照（否(fǒu)則出(chū)現雜帶(dài)不知道如(rú)何分(fēn)析）；

（3）轉(zhuǎn)膜(mó)液(yè)中(zhōng)甲(jiǎ)醇含量(liáng)可適當降低，推(tuī)薦(jiàn)使(shǐ)用(yòng)濕裝轉(zhuǎn)膜效率(shuài)更(gēng)高(gāo)。

二(èr)，凝膠的配製(zhì)

製膠關鍵(jiàn)是聚合時(shí)間，分離(lí)膠(jiāo)聚合(hé)控(kòng)製在從加入10%AP和(hé)TEMED至開始凝膠(jiāo)，時間為10—20分鐘(未wan全(quán)凝(níng)聚)，濃縮(suō)膠最(zuì)佳聚合時間為(wéi)8-10min，可通過控(kòng)製AP和TEMED量來(lái)控製。

1. 凝膠質量(liáng)

不連續(xù)SDS-PAGE膠(jiāo)對(duì)凝膠的要求(qiú)較高，分(fēn)離(lí)膠(jiāo)的(dí)pH值應(yīng)在8.8左右，而濃(nóng)縮膠的pH應在(zài)6.8左右，最(zuì)好不要差過(guò)0.5個(gè)pH單(dān)位，因為(wéi)這個pH條(tiáo)件(jiàn)是保(bǎo)證(zhèng)電(diàn)泳液中的(dí)甘氨(ān)酸不(bù)電離的(dí)必要(yào)條(tiáo)件(jiàn)，也(yě)是(shì)保(bǎo)證(zhèng)能(néng)充分壓(yā)縮(suō)樣品的前提。

因此，製備凝(níng)膠的(dí)時候所用(yòng)Tris-HCl緩(huǎn)衝(chōng)液的(dí)pH值(zhí)是否(fǒu)穩(wěn)定(dìng)是(shì)很(hěn)重要(yào)的。

2. 在用ddH2O壓分離膠的時候(hòu)為什(shí)麼經(jīng)常存(cún)在中(zhōng)間(jiān)凸的現(xiàn)象？

（1）加水時不能(néng)對(duì)著膠衝(chōng)，要(yào)沿著(zhuó)玻璃板緩(huǎn)慢流(liú)行；

（2）加水滿後(hòu)一定(dìng)要保證上(shàng)方(fāng)水(shuǐ)平(píng)麵(miàn)是平(píng)齊的；

（3）加膠要(yào)避免氣(qì)泡，也要(yào)避免加膠(jiāo)太慢(màn)而提前凝固等現象；

三(sān)，電泳(yǒng)

1. 應待凝膠充(chōng)分(fēn)凝固後電泳，或者催化(huà)劑加(jiā)入後(hòu)充分(fēn)混匀(yún)，否(fǒu)則條(tiáo)帶(dài)容(róng)易中(zhōng)間凹(āo)陷兩邊(biān)翹起(qǐ)。

2. 兩板玻(bō)璃(lí)之間排(pái)除所有的氣泡(pào)，防止條(tiáo)帶中(zhōng)間(jiān)鼓(gǔ)兩邊下陷。

3. 加(jiā)樣前離(lí)心，選擇(zé)適(shì)當(dāng)的(dí)樣本緩衝液（盡(jìn)量用新鮮配製的，這樣能保證(zhèng)pH值和離子(zǐ)強度的穩(wěn)定(dìng)），加適量的樣品促溶劑，防止(zhǐ)wb條帶(dài)拖尾或蛋(dàn)白(bái)出現(xiàn)紋(wén)理。

4. 常用濃縮時80V，分(fēn)離時(shí)100V比較好，條(tiáo)帶很平(píng)。

更(gēng)多(duō)有(yǒu)關WB實(shí)驗(yàn)的影(yǐng)響(xiǎng)因(yīn)素，請聯(lián)係北京百奧創新科(kē)技(jì)有限(xiàn)公(gōng)司。