碧(bì)雲(yún)天(tiān) LipoInsect轉染試劑(jì)(C0551-7.5ml)是一(yī)種基於(yú)陽離子脂質體等最新(xīn)轉(zhuǎn)染技術的(dí)非(fēi)常(cháng)高(gāo)效的新(xīn)型(xíng)昆(kūn)蟲(chóng)細胞(bāo)轉(zhuǎn)染(rǎn)試劑。本產(chǎn)品轉染效率(shuài)高，操作(zuò)簡單(dān)，細胞毒性低(dī)，重(zhòng)復(fù)性(xìng)好，達到了國(guó)際最主(zhǔ)流(liú)昆蟲(chóng)細(xì)胞轉染試(shì)劑(jì)的(dí)轉染效(xiào)果。

本產品適用於將(jiāng)pFastBac1等(děng)杆狀病(bìng)毒(dú)表達載(zǎi)體(tǐ)質粒(lì)DNA轉染(rǎn)到(dào)Sf9，Sf21和(hé)High Five™等昆(kūn)蟲(chóng)細(xì)胞以用於(yú)Bac-to-Bac®，BaculoDirect™和InsectSelect™表達(dá)係(xì)統(tǒng)的蛋白(bái)表(biǎo)達(dá)。LipoInsect™轉染(rǎn)試劑(jì)操作簡(jiǎn)單，使用(yòng)方法和常用(yòng)的(dí)Cellfectin® II Reagent完quan一致。LipoInsect™轉染試劑轉染過表達質粒後，通(tōng)常96小時(shí)後(hòu)達到較(jiào)高(gāo)的(dí)蛋白(bái)表達(dá)水平(píng)。LipoInsect™轉染(rǎn)試劑的轉染(rǎn)效(xiào)果可(kě)以通(tōng)過轉(zhuǎn)染表(biǎo)達EGFP等熒光蛋(dàn)白的bacmid進行快(kuài)速鑒定。

操作使用(yòng)：

1. Bacmid轉染：

a. 昆蟲(chóng)細(xì)胞(bāo)培養(yǎng)：按(àn)照(zhào)每(měi)孔約(yuē)80萬(wàn)Sf9或(huò)Sf21細(xì)胞(具體的(dí)細胞(bāo)數量據細胞(bāo)類型(xíng)，大小和細胞生長(cháng)速(sù)度(dù)等而定(dìng))用正常的細胞培養液(yè)接種到(dào)六孔板內(nèi)，使(shǐ)細胞(bāo)密(mì)度能達(dá)到(dào)約70-90%。在27-28℃培養，後(hòu)續轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)也(yě)在(zài)該溫度下進行。

b. 15分鐘(zhōng)後，將正常(cháng)的細胞(bāo)培養液更換為(wéi)平(píng)板培養液(yè)(含1.5%胎牛血清(qīng)不含(hán)抗(kàng)生(shēng)素的(dí)SFX-INSECT培(péi)養液)每孔0.8ml。

c.對於(yú)待轉染的(dí)六(liù)孔(kǒng)板(bǎn)中每(měi)一個(gè)孔的細(xì)胞，取兩個(gè)潔淨(jìng)無(wú)菌(jūn)離(lí)心管，分(fēn)別(bié)加(jiā)入100μl不含血(xiě)清(qīng)和抗(kàng)生素的SFX-INSECT昆蟲(chóng)細胞(bāo)培(péi)養(yǎng)液用(yòng)於稀釋bacmid和轉(zhuǎn)染試(shì)劑。其中一(yī)管(guǎn)加入(rù)16μg bacmid，並(bìng)用(yòng)槍(qiāng)輕輕吹打混匀；另(lìng)一管加入(rù)8μl LipoInsect™轉(zhuǎn)染(rǎn)試劑，用(yòng)槍(qiāng)輕輕吹打(dǎ)混匀，或者(zhě)輕微Vortex混(hùn)匀，但(dàn)不(bù)可離心。稀(xī)釋的(dí)bacmid和轉染(rǎn)試劑(jì)室溫(wēn)靜置約2-5min(最(zuì)多(duō)不(bù)得(dé)超過30分鐘(zhōng))。隨即把稀(xī)釋(shì)的(dí)bacmid用移液器輕(qīng)輕(qīng)加入(rù)到(dào)稀(xī)釋的(dí)LipoInsect™轉染試劑中(zhōng)，輕(qīng)輕(qīng)顛倒離心管或(huò)者(zhě)用槍輕輕(qīng)吹打混匀，室溫靜(jìng)置(zhì)15-30分鐘。

d. 按照六(liù)孔(kǒng)板每孔200μl LipoInsect™轉染(rǎn)試(shì)劑(jì)-bacmid混(hùn)合物的用(yòng)量(liáng)，均匀(yún)滴加到整個孔(kǒng)內(nèi)，隨(suí)後輕輕混(hùn)匀。

e. 為(wéi)達到最高(gāo)的轉染效(xiào)率(shuài)，細(xì)胞(bāo)在(zài)轉(zhuǎn)染(rǎn)後(hòu)培養3-5小時後宜更(gēng)換(huàn)為(wéi)新(xīn)鮮的wan全(quán)培(péi)養液(yè)(對於Sf9細胞(bāo)，推(tuī)薦(jiàn)在(zài)轉(zhuǎn)染4小(xiǎo)時(shí)後更換培養液)。

f. 繼(jì)續在(zài)27-28℃培(péi)養(yǎng)約96小時(shí)後(hòu)，收(shōu)集每孔的培(péi)養液，500g離心5分(fēn)鐘，獲得的上(shàng)清即(jí)為P1代杆(gān)狀病毒(dú)(病毒滴(dī)度通常為1×106~1×107 pfu/ml)。P1代病(bìng)毒4℃避(bì)光保存，如果包(bāo)裝病毒時(shí)的(dí)細胞培養(yǎng)液為無血清(qīng)培養液宜添(tiān)加胎牛血清(qīng)至終(zhōng)濃度為2%以保護病毒被(bèi)蛋白(bái)酶降解。P1代病(bìng)毒近(jìn)期不(bù)使(shǐ)用(yòng)的情況(kuàng)，可以(yǐ)適(shì)當分(fēn)裝後-80℃長期(qī)保(bǎo)存。盡量避(bì)免(miǎn)反復凍(dòng)融(róng)病毒，反(fǎn)復凍(dòng)融(róng)可(kě)能(néng)導致病(bìng)毒(dú)滴度下降10-100倍(bèi)。

g. 為獲(huò)得更高(gāo)滴(dī)度(dù)的(dí)杆狀病毒，可以(yǐ)使(shǐ)用P1代(dài)病(bìng)毒感(gǎn)染(rǎn)Sf9或(huò)Sf21細胞等(děng)來獲得P2代杆狀病(bìng)毒(病毒滴度(dù)通常(cháng)為1×107 ~1×108pfu/ml)。具(jù)體操作請(qǐng)參照昆(kūn)蟲(chóng)細胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的(dí)相(xiāng)關操(cāo)作規程。大(dà)致的(dí)步驟為(wéi)使用P1代病毒感(gǎn)染2×106個(gè)貼(tiē)壁(bì)約1小時(shí)的(dí)Sf9或Sf21細胞(bāo)，推薦(jiàn)的病(bìng)毒的MOI為(wéi)0.05-0.1，過高的MOI會導致獲得(dé)的病毒(dú)質量下(xià)降(jiàng)。27-28℃培養48小(xiǎo)時(shí)後，同步(bù)驟f收(shōu)集每孔(kǒng)的培養液，隨後500g離心5分(fēn)鐘，獲(huò)得(dé)的上清(qīng)即為(wéi)P2代杆狀病(bìng)毒(dú)。P2代病毒的保存條件同(tóng)P1代。由於杆狀病毒在每一(yī)代的(dí)擴(kuò)增過程中均(jūn)易(yì)出現缺少突變，因(yīn)此推(tuī)薦最多(duō)擴增至P3代病毒(dú)。

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