q是指在PCR體(tǐ)係(xì)中(zhōng)加入熒光(guāng)染料或(huò)熒光探(tàn)針，利用(yòng)熒光信號(hào)積(jī)累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最後通過C-值(zhí)和(hé)標(biāo)準曲(qū)綫對(duì)未知(zhī)模板(bǎn)進行定量分析(xī)的(dí)方法。那麼你知(zhī)道qPCR實驗的(dí)注(zhù)意(yì)事項(xiàng)有(yǒu)哪(nǎ)些嗎(má)？讓我們一起來(lái)看(kàn)看(kàn)吧(bā)！
 

　　一，模板製備
 

　　在進(jìn)行qPCR實(shí)驗時，需(xū)要根據所(suǒ)用試劑(jì)盒說(shuō)明書(shū)加入適(shì)量(liáng)的起始(shǐ)核(hé)酸模(mó)板(bǎn)，過(guò)多(duō)的(dí)模(mó)板(bǎn)可能提高汙染(rǎn)物(wù)含量(liáng)，大大降(jiàng)低(dī) PCR 效率，過少的(dí)模(mó)板(bǎn)可能會(huì)降(jiàng)低檢測(cè)靈敏(mǐn)性和重復性。
 

　　根(gēn)據(jù)檢(jiǎn)測(cè)靶(bǎ)標(biāo)的性質(zhì)特點，選擇合(hé)適的(dí)核酸(suān)抽提試(shì)劑(jì)盒同樣至關重(zhòng)要。小編(biān)有(yǒu)遇(yù)到老(lǎo)師想要通(tōng)過(guò)qPCR的方法完成對(duì)microRNA的定(dìng)量，但(dàn)是(shì)發現(xiàn)待檢測樣本中目(mù)標(biāo)microRNA和(hé)內參基(jī)因(yīn)的(dí)擴(kuò)增曲綫出(chū)峰(fēng)時間(jiān)都比較晚(wǎn)，內參基因的Ct值(zhí)甚至大(dà)於(yú)30(圖2)。排(pái)除實驗操(cāo)作問題後發(fā)現(xiàn)原來是因為(wéi)所(suǒ)使用RNA抽提(tí)試劑盒(hé)對小(xiǎo)片段的microRNA回(huí)收(shōu)效(xiào)率低，不適(shì)合(hé)用(yòng)於下遊microRNA定量實驗(yàn)。
 

　　二(èr)，引物探針的(dí)設計(jì)及儲存
 

　　除了要(yào)保證模板(bǎn)的質(zhì)量外，引(yǐn)物(wù)探針的設(shè)計(jì)和(hé)穩定性同(tóng)樣(yàng)至(zhì)關重(zhòng)要。當我(wǒ)們根(gēn)據(jù)檢測靶(bǎ)標(biāo)設計特(tè)異(yì)性(xìng)引物(wù)和(hé)探(tàn)針(zhēn)時，除(chú)了(liǎo)要(yào)考(kǎo)慮片段長度，Tm值，鹼基(jī)組成等基(jī)本(běn)要(yào)點外(wài)，還需格外(wài)注(zhù)意引物(wù)，探(tàn)針自身不能(néng)形成復雜的二(èr)級結構，上下遊(yóu)引(yǐn)物內部，引(yǐn)物探(tàn)針(zhēn)之間(jiān)不能(néng)出現結合的現(xiàn)象(xiàng)，因為(wéi)這些都可能影響引物探(tàn)針與目(mù)標基因的結合，進而(ér)影響(xiǎng)最(zuì)終的擴增(zēng)效率。
 

　　除了(liǎo)引(yǐn)物(wù)探針(zhēn)在(zài)設計時(shí)需(xū)要格外花(huā)費(fèi)心思外，收到(dào)合成好的(dí)引物(wù)，探針如何稀釋(shì)，如何保存同樣有(yǒu)小(xiǎo)tips。如(rú)果我(wǒ)們(mén)合(hé)成的引(yǐn)物探針是(shì)幹粉(fěn)狀或是需要稀(xī)釋時，為(wéi)了(liǎo)保(bǎo)證引物探針的(dí)穩定性(xìng)建議用1×TE buffer去溶解(jiě)和(hé)稀釋(shì)。另(lìng)外，引(yǐn)物的儲存濃度(dù)也(yě)可能影(yǐng)響其穩定性(xìng)，建議引(yǐn)物(wù)的(dí)儲存(cún)濃度不(bù)低於(yú) 10 μM，一般為100 μM 。此外(wài)如果引物(wù)和探針(zhēn)每次使(shǐ)用量(liáng)較(jiào)少時，還(huán)應(yīng)該進行分(fēn)裝(zhuāng)，保存(cún)在(zài)-20℃，以(yǐ)減(jiǎn)少反復(fù)凍融的(dí)次數。
 

　　更多有(yǒu)關(guān)qPCR實(shí)驗(yàn)的注(zhù)意事項(xiàng)，請聯係(xì)天(tiān)津益元(yuán)利康(kāng)生(shēng)物科(kē)技(jì)有限公(gōng)司。