產(chǎn)品名稱：abclonal愛(ài)博泰克SARS-CoV-2 N蛋白(bái)多抗(A20607)現貨供(gōng)應

產(chǎn)品貨(huò)號：A20607

產品品牌：abclonal愛(ài)博(bó)泰克

產品背(bèi)景(jǐng)：將正鏈病毒基因組(zǔ)RNA包裝(zhuāng)成螺旋(xuán)核(hé)糖(táng)核衣(yī)殼（RNP），通過與病毒(dú)基(jī)因組和膜蛋白(bái)M的相(xiāng)互(hù)作用(yòng)，在病毒(dú)粒(lì)子組裝(zhuāng)過(guò)程中發揮重要作用(yòng)。可能通過結(jié)合宿主 SMAD3 調節轉化生長(cháng)因子-β 信號轉導。

實驗流程：

蛋(dàn)白(bái)免(miǎn)疫(yì)印(yìn)跡(jì)實驗(yàn)步驟：

1
，樣品製備(bèi)

（1）細(xì)胞收集(jí)

a. 貼壁(bì)培養細(xì)胞收(shōu)集

用細(xì)胞(bāo)刮(guā)刮(guā)下細胞或用胰酶消化處理(lǐ)後，400×g，離心(xīn)5 min，棄(qì)上(shàng)清；用(yòng)適量冰(bīng)PBS溶液將(jiāng)離心後(hòu)細胞(bāo)沉澱重懸，4℃，400×g 離心(xīn)5min,棄(qì)上清，重(zhòng)復(fù)清洗步驟一(yī)次(cì)收(shōu)集(jí)細胞沉(chén)澱。

b. 懸浮培(péi)養細胞(bāo)收集

收(shōu)集(jí)懸浮細胞，400×g離(lí)心(xīn)5min，棄上清，適(shì)量冰(bīng)PBS溶液(yè)將(jiāng)離心後(hòu)細胞沉澱(diàn)重懸，4℃，400×g 離(lí)心(xīn)5min,棄上(shàng)清，重復清(qīng)洗步驟一(yī)次，收(shōu)集細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)。

c. 組織(zhī)樣本(běn)收集

把(bǎ)組(zǔ)織在預冷的(dí)表麵上(shàng)剪切成細小碎塊(kuài)，然後用液氮(dàn)或超低溫(wēn)冰箱(xiāng)中冷凍(dòng)組(zǔ)織30min以(yǐ)上(shàng)，迅速(sù)加液氮研(yán)磨，研磨過程盡(jìn)量(liáng)控(kòng)製(zhì)在1~2min之內(nèi)，以減(jiǎn)少蛋(dàn)白(bái)的降解。

（2）總蛋白提(tí)取(qǔ)

a. 細胞/組織裂(liè)解：

根據收集的(dí)細胞(bāo)數量(liáng)
，細胞種(zhǒng)類添加適量(liáng)的裂解液。

例(lì)如常(cháng)規(guī)細胞(bāo)沉澱可按(àn)照(zhào)1mL裂解(jiě)液/107個細(xì)胞的(dí)比(bǐ)例加入(rù)相應體(tǐ)積的裂解液，加入裂(liè)解液後將(jiāng)沉澱(diàn)吹打混(hùn)匀。使用細胞(bāo)破碎儀(yí)超(chāo)聲樣本(běn)，每次(cì)超聲時間4-5s,間隔時間在5s左右，肉(ròu)眼(yǎn)觀察，樣本為均(jūn)一(yī)，不粘稠液(yè)體(tǐ)即可。或采用震蕩(dàng)裂(liè)解(jiě)方式進行，每隔5min將離(lí)心管(guǎn)置於渦旋振蕩儀上震蕩(dàng)10s，裂解20min。

組織碎(suì)片可(kě)按(àn)照(zhào)0.5mL 裂解液/100mg組(zǔ)織向匀漿(jiāng)器(qì)中加入蛋白(bái)裂(liè)解(jiě)液，每(měi)3min研磨(mó)一次，重復(fù)5次(cì)，使組織(zhī)盡量(liáng)碾碎（裂解(jiě)液中根據需要添加或不(bù)添(tiān)加(jiā)蛋白(bái)酶抑(yì)製劑）。所(suǒ)有(yǒu)理解(jiě)過(guò)程(chéng)，務必在低(dī)溫(wēn)條(tiáo)件下進行。

b. 離心：

把裂解(jiě)好的樣品(pǐn)配平(píng)後(hòu)，將(jiāng)裂解好(hǎo)的(dí)樣本置於預冷的高(gāo)速冷凍離(lí)心機(jī)中(zhōng)，13000×g離心10min，收集(jí)上清(qīng)

c. 蛋白(bái)變性(xìng)：

吸取少量蛋(dàn)白提(tí)取(qǔ)液做(zuò)蛋白濃(nóng)度測定。向(xiàng)剩餘(yú)的(dí)蛋白提(tí)取液的離心管(guǎn)中加(jiā)入對(duì)應體積的(dí)5× Loading Buffer（最終工作液為(wéi)1×)，待(dài)幹(gān)式恒(héng)溫器溫(wēn)度升(shēng)至95℃後，將1.5mL離心(xīn)管插入加熱(rè)孔(kǒng)中，95℃加(jiā)熱(rè)變性10min，待(dài)液(yè)體(tǐ)冷(lěng)卻後(hòu)置於-20℃保(bǎo)存(cún)。

（3）蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)測定（BCA法(fǎ)）

a. BCA工(gōng)作(zuò)液(yè)的配置

根據樣品數量(liáng)，按(àn)50體積(jī)BCA試(shì)劑A加入1體積(jī)BCA試劑(jì)B（50:1）配(pèi)置(zhì)適(shì)量(liáng)BCA工作液，充分(fēn)混匀(yún)。BCA工作液室溫24h內穩定。

b. BSA標(biāo)準品(pǐn)梯(tī)度稀(xī)釋

取10μl蛋白(bái)標(biāo)準(zhǔn)品（5 mg/mL BSA）稀釋(shì)至(zhì)50μl，使終濃度為(wéi)1mg/ml。稀釋(shì)後的(dí)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可以-20℃長期保(bǎo)存。此標準品(pǐn)溶液的稀釋(shì)液可(kě)使用去離子(zǐ)水或1×PBS。將標(biāo)準品(pǐn)按0
，1
，2
，4
，8
，12
，16
，20μl加(jiā)入到96孔(kǒng)板(bǎn)中，加稀(xī)釋液補足(zú)到(dào)20μl。

c. 樣(yàng)本濃度測定(dìng)

加適(shì)當(dāng)體(tǐ)積樣(yàng)品到(dào)96孔板的(dí)樣(yàng)品(pǐn)孔中，如果樣(yàng)本(běn)不足20μl，需加(jiā)稀釋液補足到20μl。每(měi)孔加(jiā)入 200μl BCA工(gōng)作液，37℃放置(zhì)20-30min。用(yòng)酶標儀(yí)測定樣(yàng)本和標準(zhǔn)品(pǐn)在562nm下的吸光度，或在540-595nm之間波(bō)長下(xià)的吸(xī)光度。根據BSA蛋白(bái)濃度(dù)標準曲綫(xiàn)和使(shǐ)用的(dí)樣品體積計算(suàn)出(chū)樣品的蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)。

2
，凝(níng)膠電(diàn)泳(yǒng)

（1）製膠(jiāo)器(qì)安裝

根(gēn)據(jù)使用說(shuō)明(míng)書(shū)安裝。

（2）凝(níng)膠配置(zhì)

根(gēn)據目(mù)標(biāo)蛋(dàn)白大小(xiǎo)，選(xuǎn)擇不(bù)同合適濃(nóng)度(dù)的(dí)分離膠（見(jiàn)附(fù)表(biǎo)）。注意該(gāi)過程注意不(bù)能有氣(qì)泡(pào)產生。

（3）上(shàng)樣(yàng)

待膠(jiāo)凝(níng)固好(hǎo)後(hòu)，用(yòng)移液器吸取(qǔ)樣(yàng)品(pǐn)垂(chuí)直(zhí)梳孔(kǒng)上樣(yàng)，建(jiàn)議(yì)總(zǒng)蛋白(bái)上(shàng)樣(yàng)量(liáng)25ug/孔(kǒng)。注意內槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需(xū)注滿，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過底(dǐ)部3~5cm即(jí)可。

（4）電泳(yǒng)

上樣(yàng)完(wán)成後，連通電泳儀(yí)電源，注意正負(fù)極(jí)需(xū)連接正確(què)，設定(dìng)適宜(yí)的電泳(yǒng)參數(shù)。建議(yì)濃縮膠電(diàn)泳參數為恒(héng)壓(yā)80V，分離(lí)膠采用恒壓(yā)120V。當溴(xiù)酚(fēn)藍電泳到凝膠底部時(shí)，停(tíng)止電泳，關閉電泳儀(yí)電源。

3
，轉(zhuǎn)膜(mó)

（1）準備工作

a. 轉膜(mó)緩(huǎn)衝液可提前2h （即(jí)開(kāi)始電(diàn)泳(yǒng)後(hòu)）放入-20℃冰(bīng)箱預(yù)冷(lěng)。

b. 根據膠(jiāo)的麵(miàn)積大小，將濾(lǜ)紙(zhǐ)以(yǐ)及NC膜剪裁(cái)至合(hé)適(shì)尺(chǐ)寸(cùn)。

c. 建議目的(dí)蛋(dàn)白大(dà)於20KD可(kě)選(xuǎn)擇0.45μm NC膜(mó)；目的蛋白小於20KD可(kě)選擇0.2μm的(dí)NC膜或0.22μm的PVDF膜(mó)。選(xuǎn)擇(zé)完畢(bì)後(hòu)將膜放在Western Transfer Buffer中(zhōng)浸泡備用。注(zhù)意(yì)使用(yòng)PVDF膜需先(xiān)放入(rù)甲醇(chún)中浸(jìn)泡1min左(zuǒ)右(yòu)至(zhì)均匀浸透(tòu)，沒有白(bái)點(diǎn)即可(kě)放入Western Transfer Buffer中浸(jìn)泡備用。

（2）轉膜(mó)

根(gēn)據目的蛋白(bái)大小，選擇合適的(dí)轉(zhuǎn)膜條件(jiàn)（見(jiàn)附表）。

4
，封閉

轉膜完成後(hòu)，將(jiāng)膜取(qǔ)出(chū)，放入(rù)合(hé)適(shì)的抗(kàng)體孵育槽中(zhōng)，加入(rù)Western Blocking Buffer 室溫孵(fū)育(yù)1h，加(jiā)入(rù)TBST Buffer洗滌(dí)3次，每次5 min。

5
，抗體孵育(yù)

根據所(suǒ)使(shǐ)用的一(yī)抗種類，選(xuǎn)擇進行(háng)下述(shù)其(qí)中(zhōng)1項(xiàng)的(dí)具體步驟(zhòu)

（1）對於無偶(ǒu)聯的一(yī)抗

a. 將一(yī)抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按(àn)照(zhào)抗體說明(míng)書推薦(jiàn)比例進(jìn)行稀(xī)釋(shì),室溫孵(fū)育1.5h或(huò)4℃過(guò)夜(yè)孵育。

b. TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)4次，每次5 min。

c. 按一(yī)抗(kàng)來源選取(qǔ)合適(shì)的(dí)HRP偶聯(lián)二抗，按照合(hé)適比例(lì)進行稀釋(shì)，室(shì)溫(wēn)孵(fū)育(yù)1h。

d. TBST Buffer洗滌(dí)4次，每(měi)次(cì)5 min。

e. 繼續進(jìn)行(háng)後(hòu)續曝(pù)光操作。

（2）對於偶聯有HRP的一抗

a. 將一抗用(yòng)Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按(àn)照抗體說明(míng)書推薦比(bǐ)例(lì)進行(háng)稀釋(shì),室溫孵育(yù)1.5h或(huò)4℃過夜孵育。

b. 用TBST Buffer洗滌(dí)4次(cì)，每(měi)次5 min。

c. 繼續(xù)進(jìn)行(háng)後續曝光(guāng)操作(zuò)。

6
，曝(pù)光(guāng)

a. 吸(xī)取(qǔ)等體積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混(hùn)匀，配(pèi)製成發(fā)光(guāng)檢測工作液。推薦用量為(wéi)每10cm2的膜(mó)使用1-2 mL發(fā)光(guāng)檢測(cè)工作液即可(kě)。

b. 用鑷(niè)子(zǐ)將(jiāng)膜(mó)取出(chū)，膜(mó)的(dí)下緣輕輕(qīng)接觸吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)，去除膜上多(duō)餘(yú)的液體(tǐ)。用(yòng)移液槍吸取工作液(yè)並均匀(yún)覆蓋(gài)轉印(yìn)膜，室溫(wēn)孵(fū)育(yù) 1-2 minutes，此(cǐ)步驟可在(zài)潔淨保鮮膜上或塑料盒(hé)中完成。

c. 獲取(qǔ)WB結果(guǒ)：

1) 傳(chuán)統壓(yā)片(piàn)曝(pù)光顯影：將膜固(gù)定於片(piàn)夾(jiā)內(nèi)。暗室內(nèi)壓(yā)片1分鐘(zhōng)，立(lì)即(jí)顯影(yǐng)定影，根據結果(guǒ)再調(tiáo)整壓片時間獲取最(zuì)佳信噪比圖(tú)片(piàn)。或直(zhí)接(jiē)分別(bié)壓(yā)片 30 秒
，1
，3
，5分(fēn)鐘，然後(hòu)一(yī)起顯影定(dìng)影觀察(chá)結果(guǒ)。

2) 化學發(fā)光(guāng)成像儀(yí)獲(huò)取電子圖片(piàn)：將(jiāng)膜放置到(dào)成(chéng)像儀內，參(cān)考儀器說明書(shū)設置合(hé)適(shì)的(dí)參數(shù)以獲(huò)取(qǔ)優化圖(tú)片。同時應(yīng)根據靶(bǎ)蛋白的生物學(xué)性質如豐度等來(lái)調(tiáo)節成(chéng)像(xiàng)參數。

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