產(chǎn)品名(míng)稱：碧雲天beyotime免疫沉澱試劑(jì)盒(Protein A+G磁(cí)珠(zhū)法(fǎ))(P2179S)現貨(huò)供(gōng)應

產品(pǐn)貨號：P2179S

產品(pǐn)品牌：碧(bì)雲(yún)天(tiān)beyotime

使(shǐ)用方法：

1.試劑(jì)盒的(dí)準(zhǔn)備。

a.參(cān)考下表(biǎo)，按(àn)照每個(gè)樣(yàng)品使用100-500μl裂解液的比例(lì)，準備相關(guān)試劑(jì)。

b.含(hán)抑製劑(jì)裂解液的配(pèi)製。參考(kǎo)上表，按(àn)照每(měi)50-100萬(wàn)細胞使用100-200μl含抑(yì)製劑(jì)裂解(jiě)液用(yòng)於(yú)裂(liè)解以(yǐ)及300-600μl含(hán)抑製劑(jì)裂解液(yè)用於(yú)洗(xǐ)滌的比(bǐ)例，配(pèi)製適量的含抑製(zhì)劑裂解液。將(jiāng)Lysis Buffer與Protease Inhibitor Cocktail (100X)按照(zhào)100:1的比(bǐ)例(lì)混合(hé)，例如在(zài)1ml的Lysis Buffer中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)，即(jí)得1ml含(hán)抑(yì)製(zhì)劑(jì)裂(liè)解液(Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail)。配(pèi)製(zhì)好的含(hán)抑製劑裂(liè)解液(yè)宜放置在冰浴或4℃。

注1：如(rú)果(guǒ)免疫(yì)沉(chén)澱的目的蛋白(bái)涉(shè)及(jí)磷酸化(huà)修飾或者(zhě)乙(yǐ)酰(xiān)化修飾，需要(yào)添(tiān)加磷酸(suān)酶抑(yì)製劑或去乙(yǐ)酰化酶抑製劑。推(tuī)薦(jiàn)使用碧雲(yún)天的(dí)磷酸酶抑製劑混合物A (50X) (P1081/P1082)和去(qù)乙(yǐ)酰(xiān)化(huà)酶抑製劑混合(hé)物(wù)(100X) (P1112/P1113)。如果有特(tè)殊需求(qiú)，可(kě)考(kǎo)慮(lǜ)選(xuǎn)擇其(qí)它(tā)適(shì)當的抑(yì)製劑混(hùn)合物。

注2：本試(shì)劑盒提供(gōng)的(dí)Lysis Buffer不(bù)僅(jǐn)用於(yú)樣(yàng)品(pǐn)裂解，也用於(yú)後(hòu)續的洗(xǐ)滌步驟，請特別(bié)注意“注意事項(xiàng)"中的(dí)相(xiāng)關(guān)描述。

注3：含抑(yì)製劑(jì)裂解(jiě)液宜(yí)現用現(xiàn)配，不(bù)宜配製後(hòu)凍(dòng)存並留(liú)作後續(xù)使(shǐ)用。如果有特殊需求，可(kě)以(yǐ)嘗試碧雲(yún)天的其(qí)它(tā)多種蛋白酶，磷酸酶和(hé)去(qù)乙酰化酶(méi)抑(yì)製劑(jì)混(hùn)合(hé)物(wù)。

c.TBS的配製。將(jiāng)TBS (10X)用(yòng)超(chāo)純水水(shuǐ)稀(xī)釋(shì)至1X，即為TBS。例如1ml TBS (10X)加(jiā)入9ml超(chāo)純水，混(hùn)匀(yún)後即為(wéi)TBS。

d.磁(cí)珠的準備。由於(yú)磁珠儲(chǔ)存在(zài)特殊保(bǎo)護(hù)液中(zhōng)，所(suǒ)以(yǐ)需要在(zài)加(jiā)入樣品前(qián)適當洗(xǐ)滌(dí)。

(a)用移液(yè)器輕輕(qīng)吹打重懸磁珠，按(àn)照每(měi)500μl樣品(pǐn)使(shǐ)用(yòng)20μl磁珠懸濁(zhuó)液(yè)比例，取適量磁(cí)珠(zhū)至一(yī)潔淨離(lí)心(xīn)管中(FTUB015)，加入TBS至最(zuì)終(zhōng)體積為(wéi)約0.5ml。說明：如果初始磁(cí)珠體積(jī)大於0.2ml，可以考(kǎo)慮先直接置於(yú)磁力架上分(fēn)離(lí)10秒，去(qù)除上(shàng)清，然(rán)後(hòu)再(zài)加入TBS至最終體積(jī)為(wéi)約0.5ml。

(b)用(yòng)移液(yè)器輕輕吹打(dǎ)重懸磁(cí)珠(zhū)。置於磁力架上分離(lí)10秒(miǎo)，去除(chú)上清(qīng)。重復上述步驟(zhòu)兩次(cì)。

(c)按照初(chū)始(shǐ)體(tǐ)積的量(liáng)，用TBS重懸磁珠(zhū)。

e.SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配製。取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)用(yòng)水(shuǐ)稀(xī)釋(shì)5倍(bèi)即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。例(lì)如0.2ml SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)加(jiā)入(rù)0.8ml超純水，混(hùn)匀後(hòu)即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2.細(xì)胞(bāo)或組織樣品的(dí)裂解和準備(bèi)。樣品裂(liè)解後(hòu)宜立(lì)即進行(háng)後續的免(miǎn)疫(yì)沉澱(diàn)或(huò)免疫(yì)共沉澱，如(rú)果不(bù)能立(lì)即進(jìn)行後續(xù)的(dí)實驗(yàn)，可以-20℃或(huò)-80℃凍存，但凍融可能(néng)會(huì)影(yǐng)響蛋白與蛋白的相互作用(yòng)。所(suǒ)有的樣(yàng)品(pǐn)裂解步驟(zhòu)宜在(zài)冰(bīng)浴或4℃操(cāo)作，以盡(jìn)量減少蛋白降(jiàng)解的(dí)可能性。樣品(pǐn)準(zhǔn)備好(hǎo)後(hòu)，注意取一定量作為Input或Total，以用(yòng)於後(hòu)續的Western等檢測。

a.懸浮細(xì)胞(bāo)的(dí)樣(yàng)品(pǐn)裂(liè)解和準(zhǔn)備(bèi)。250-1000×g室溫離心(xīn)5min收(shōu)集(jí)細胞(bāo)。如有必(bì)要，可(kě)以(yǐ)使用PBS洗滌一次，然後吸淨殘(cán)留的液(yè)體(tǐ)。輕輕(qīng)vortex或者(zhě)彈擊(jī)管底(dǐ)以把(bǎ)細(xì)胞盡量分散(sàn)開(kāi)。按照(zhào)每50-100萬(wàn)細胞(bāo)加(jiā)入100-200μl的比例加(jiā)入(rù)含抑製劑裂解液。輕彈管(guǎn)底或(huò)適當吹打，以充分(fēn)裂解細(xì)胞。充(chōng)分(fēn)裂解後應(yīng)沒有明(míng)顯的細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)。如(rú)果細胞(bāo)量較多(duō)，建議(yì)分裝(zhuāng)成(chéng)50-100萬(wàn)細胞(bāo)/管，然(rán)後(hòu)再(zài)裂解。大團的細胞較(jiào)難(nán)裂解(jiě)充(chōng)分(fēn)，而(ér)少量(liáng)的(dí)細胞由(yóu)於裂解液容易和(hé)細(xì)胞充分接觸，相對比(bǐ)較容易(yì)裂解(jiě)充(chōng)分。充分裂(liè)解(jiě)後，10,000-14,000×g在4℃離(lí)心3-5分(fēn)鐘，取上清，即(jí)可(kě)進行後(hòu)續的免疫(yì)沉澱(diàn)和免(miǎn)疫(yì)共沉澱等。注：裂解後會(huì)出現(xiàn)少量不(bù)溶性物質，主要(yào)為基因組DNA等(děng)，離(lí)心(xīn)後會(huì)產(chǎn)生沉(chén)澱(diàn)物(wù)。

b.貼(tiē)壁細胞樣品的(dí)裂解(jiě)和(hé)準(zhǔn)備。吸除(chú)培(péi)養液。如有(yǒu)必要(yào)，用PBS洗(xǐ)滌(dí)一次，然後(hòu)吸(xī)淨(jìng)殘留的液體(tǐ)。按照每50-100萬細(xì)胞(bāo)(相當於(yú)6孔板的一(yī)個孔)加入100-200μl的含抑製劑裂解液，適(shì)當吹(chuī)打，使(shǐ)裂解(jiě)液和(hé)細(xì)胞(bāo)充分(fēn)接(jiē)觸。通常(cháng)裂(liè)解(jiě)液接觸(chù)動(dòng)物(wù)細胞(bāo)1-2秒(miǎo)後，細胞(bāo)就(jiù)會被裂(liè)解(jiě)。植(zhí)物細胞宜(yí)在(zài)冰上裂解2-10min。充(chōng)分(fēn)裂(liè)解後，10,000-14,000×g在(zài)4℃離心(xīn)3-5分鐘(zhōng)，取上清，即(jí)可進行後續(xù)的免疫(yì)沉(chén)澱和免(miǎn)疫共沉(chén)澱等。注：裂解(jiě)後會出現(xiàn)少量不(bù)溶性(xìng)物(wù)質，主要(yào)為(wéi)基(jī)因組(zǔ)DNA等(děng)，離心後會(huì)產(chǎn)生(shēng)沉(chén)澱物(wù)。

c.細菌(jūn)或(huò)酵(jiào)母樣品(pǐn)的(dí)裂(liè)解和(hé)準備(bèi)。對(duì)於(yú)1ml菌液(yè)或酵母(mǔ)液，離心去(qù)上清，如(rú)果(guǒ)有必要，可(kě)以(yǐ)使(shǐ)用PBS洗滌一次(cì)，然(rán)後(hòu)吸淨(jìng)殘(cán)留的(dí)液體(tǐ)。輕輕(qīng)vortex或者彈(dàn)擊(jī)管(guǎn)底以(yǐ)

把細菌或酵母盡量分散(sàn)開(kāi)。加入(rù)100-200μl含抑製(zhì)劑(jì)裂(liè)解(jiě)液(yè)，輕輕vortex或(huò)者彈(dàn)擊管底以(yǐ)混匀(yún)，冰上裂(liè)解(jiě)2-10min。如果(guǒ)希(xī)望(wàng)獲得更(gēng)好的(dí)裂解(jiě)效(xiào)果(guǒ)，細(xì)菌和(hé)酵(jiào)母(mǔ)可以(yǐ)分(fēn)別(bié)使(shǐ)用(yòng)溶菌酶(lysozyme)和破壁酶(méi)(lyticase)消化(huà)，然(rán)後再使用(yòng)含抑(yì)製劑裂解(jiě)液(yè)進行裂解(jiě)。充(chōng)分(fēn)裂解後，10,000-14,000×g在(zài)4℃離(lí)心3-5分(fēn)鐘(zhōng)，取上清(qīng)，即可進行後續(xù)的免疫(yì)沉澱和(hé)免(miǎn)疫(yì)共沉(chén)澱等(děng)。注(zhù)：裂(liè)解後很(hěn)可能會出現(xiàn)少量(liáng)不溶(róng)性物(wù)質，主(zhǔ)要為(wéi)基因(yīn)組(zǔ)DNA等，離(lí)心後(hòu)會產生沉澱物。

d.組織樣(yàng)品的裂(liè)解和(hé)準(zhǔn)備。

(a)把組(zǔ)織剪切(qiē)成細小的(dí)碎片。如果組織(zhī)樣品本身(shēn)非常細小，也可以(yǐ)不(bù)再進(jìn)行剪切。

(b)按照每(měi)10-20毫(háo)克(kè)組織使用(yòng)100-200μl的比例(lì)加入(rù)含抑製(zhì)劑裂解(jiě)液。如果裂(liè)解(jiě)不(bù)充分(fēn)可以(yǐ)使用(yòng)更多的含抑(yì)製劑裂解(jiě)液，如(rú)果需要高濃度(dù)的(dí)蛋白樣品，可以適(shì)當減(jiǎn)少(shǎo)裂解液(yè)的用(yòng)量。

(c)用玻璃匀漿(jiāng)器(qì)匀漿，或使用碧(bì)雲(yún)天(tiān)生(shēng)產的E6600 TissueMaster™手持(chí)式組織研磨儀研磨，直(zhí)至充(chōng)分(fēn)裂解(jiě)。也(yě)可(kě)以把組(zǔ)織樣品冷(lěng)凍後液(yè)氮研磨，研磨(mó)充分後加(jiā)入(rù)裂(liè)解與(yǔ)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)進行(háng)裂解(jiě)。

(d)充(chōng)分裂解後，10,000-14,000×g在4℃離心3-5分鐘，取上(shàng)清，即(jí)可(kě)進行(háng)後(hòu)續的(dí)免(miǎn)疫(yì)沉(chén)澱(diàn)和免疫共(gòng)沉澱(diàn)等(děng)。每20mg凍存的小鼠(shǔ)肝髒(zàng)組織(zhī)用(yòng)200μl含抑製(zhì)劑裂解液(yè)裂解(jiě)後獲(huò)得(dé)的(dí)上清，其蛋(dàn)白濃度約(yuē)為(wéi)15-25mg/ml，不(bù)同(tóng)狀(zhuàng)態的(dí)不(bù)同組(zǔ)織(zhī)有所不同。注(zhù)：裂解(jiě)後很可(kě)能會出(chū)現少量(liáng)不溶(róng)性(xìng)物質(zhì)，主(zhǔ)要(yào)為基因組(zǔ)DNA等，離心後會(huì)產(chǎn)生(shēng)沉(chén)澱物(wù)。

3.抗(kàng)體(tǐ)與Protein A+G磁珠(zhū)的(dí)結合。

a.抗(kàng)體的(dí)準備。按抗(kàng)體使(shǐ)用(yòng)說明中推薦(jiàn)的稀(xī)釋(shì)比例用TBS稀(xī)釋抗體，配製成抗體工作液(yè)；或(huò)將(jiāng)抗(kàng)體配製(zhì)成(chéng)終濃度(dù)5-50μg/ml的(dí)抗(kàng)體工作液。置於冰(bīng)上(shàng)備用(yòng)。可(kě)選做：使(shǐ)用抗體種屬(shǔ)相同(tóng)的正(zhèng)常IgG配製相同(tóng)稀釋(shì)比(bǐ)或終(zhōng)濃度(dù)的(dí)正(zhèng)常(cháng)IgG工(gōng)作液，以(yǐ)用於去除非特(tè)異性結合或作為陰(yīn)性對(duì)照。所(suǒ)謂種屬(shǔ)相(xiāng)同(tóng)的(dí)正(zhèng)常(cháng)IgG是(shì)指，例如後續(xù)免疫沉澱時(shí)用的(dí)抗體(tǐ)是小鼠(shǔ)IgG，則在(zài)本步(bù)驟(zhòu)中可(kě)以(yǐ)用TBS稀釋適量的(dí)Normal Mouse IgG等以(yǐ)用於降低(dī)背景(jǐng)或作為陰性對(duì)照。

b.抗體吸附(fù)。將步驟1d準(zhǔn)備好的Protein A+G磁(cí)珠進(jìn)行磁性(xìng)分(fēn)離，吸除上(shàng)清(qīng)，加(jiā)入(rù)500μl抗(kàng)體工作液(yè)或正(zhèng)常IgG工作液，重(zhòng)懸(xuán)後在(zài)室(shì)溫(wēn)翻(fān)轉(zhuǎn)混合儀上翻(fān)轉孵育(yù)15分鐘-1小(xiǎo)時(shí)。注(zhù)：也可(kě)以(yǐ)直接在(zài)步驟1d的Protein A+G磁珠中(zhōng)加(jiā)入適(shì)量抗(kàng)體(tǐ)或(huò)正常(cháng)IgG進行孵(fū)育。

c.洗滌(dí)。加入500μl的TBS，用(yòng)移液器輕(qīng)輕吹(chuī)打重(zhòng)懸(xuán)Protein A+G磁(cí)珠(zhū)。置於(yú)磁(cí)力(lì)架上(shàng)分離10秒，去除(chú)上(shàng)清(qīng)。重(zhòng)復洗(xǐ)滌三(sān)次。按照初始體(tǐ)積(jī)的量(liáng)，用TBS重懸Protein A+G磁珠。注(zhù)：孵(fū)育和洗(xǐ)滌過(guò)程(chéng)中，如果(guǒ)磁珠(zhū)發生(shēng)聚團(tuán)或(huò)呈片狀(zhuàng)屬正常現象，不會影(yǐng)響實(shí)驗結(jié)果。

4.免(miǎn)疫沉澱(diàn)(Immunoprecipitation, IP)。

a.去除(chú)非特異(yì)性(xìng)結(jié)合(hé)(可選做)。步驟3中準(zhǔn)備(bèi)的結合了(liǎo)正常IgG的Protein A+G磁珠(zhū)與(yǔ)樣(yàng)品(pǐn)4℃孵育1小時(shí)後磁性分(fēn)離(lí)，上清(qīng)樣品用於(yú)後續實(shí)驗。本實驗步(bù)驟(zhòu)的目(mù)的是(shì)去除與正(zhèng)常(cháng)IgG產生非特(tè)異(yì)性結(jié)合的蛋白。

b.樣品與結合了抗體或(huò)正(zhèng)常IgG的Protein A+G磁(cí)珠孵育。按照每500μl蛋(dàn)白樣品(pǐn)加入(rù)20μl磁(cí)珠(zhū)懸(xuán)濁液的比例加入結合了抗(kàng)體或正(zhèng)常IgG的(dí)Protein A+G磁珠(zhū)，置(zhì)於(yú)側擺(bǎi)搖床或旋(xuán)轉混合儀(yí)上(shàng)，室溫(wēn)孵(fū)育2小時(shí)或(huò)4℃孵(fū)育(yù)過(guò)夜(yè)。

注1：孵(fū)育過(guò)程中，如(rú)果磁珠(zhū)發(fā)生聚團或(huò)呈片(piàn)狀屬(shǔ)正常現象(xiàng)，不會(huì)影(yǐng)響(xiǎng)實(shí)驗結果。

注(zhù)2：也可(kě)先將適量抗體(tǐ)或正(zhèng)常(cháng)IgG與樣品室溫孵(fū)育(yù)1-2小(xiǎo)時(shí)或4℃孵育過(guò)夜後，再(zài)加(jiā)入(rù)10-20μl磁(cí)珠懸(xuán)濁液室溫孵(fū)育1小(xiǎo)時。具(jù)體(tǐ)見常見(jiàn)問(wèn)題(tí)2。

c.磁(cí)分離(lí)。孵(fū)育完畢後，置於(yú)磁力架上(shàng)分(fēn)離(lí)10秒(miǎo)，去除上(shàng)清(qīng)。注：可保留部(bù)分(fēn)上清液(yè)，用於檢測免(miǎn)疫沉澱的效果(guǒ)。

d.洗滌。加(jiā)入0.5ml的含抑(yì)製劑(jì)裂(liè)解液，用移液器輕(qīng)輕吹(chuī)打(dǎ)重(zhòng)懸磁珠(zhū)。置(zhì)於磁(cí)力架上(shàng)分(fēn)離10秒，去(qù)除上清。重復(fù)使(shǐ)用含(hán)抑製(zhì)劑(jì)裂解液洗滌(dí)三次。注：也可(kě)以(yǐ)通過檢(jiǎn)測洗滌得(dé)到的液體的OD280來判斷(duàn)是否洗(xǐ)滌完成(chéng)，若(ruò)OD280大於(yú)0.05，應適當(dāng)增(zēng)加洗(xǐ)滌(dí)次(cì)數。

5.洗脫(tuō)。根據(jù)標(biāo)簽蛋白的(dí)特點及(jí)後續實驗要求(qiú)，可(kě)以(yǐ)選擇如下(xià)3種方法之一(yī)進行洗(xǐ)脫(tuō)。

a.酸性洗脫(tuō)法(fǎ)。本(běn)方法為(wéi)非(fēi)變性(xìng)法，比較(jiào)快速高效。洗脫後的(dí)蛋(dàn)白很多(duō)情(qíng)況下能保持(chí)原(yuán)有的生(shēng)物活性，便(biàn)於(yú)後(hòu)續分析檢(jiǎn)測。

(a)每20μl原(yuán)始磁珠體(tǐ)積，加入100μl Acid Elution Buffer (酸(suān)性(xìng)洗脫液)，混(hùn)匀(yún)後置(zhì)於側擺搖床或旋轉混(hùn)合儀上(shàng)，室溫孵育5分鐘。注：孵育(yù)時間不宜超過15分鐘(zhōng)。

(b)孵(fū)育完(wán)畢後(hòu)，置於(yú)磁力(lì)架上(shàng)分離10秒(miǎo)，將(jiāng)上清(qīng)轉移到新(xīn)的離心(xīn)管中(zhōng)，並立(lì)刻加入10μl Neutralization Buffer (中(zhōng)和(hé)液)，適當混匀。注：須立刻(kè)加入中(zhōng)和液並混匀，否則長(cháng)時(shí)間處於酸(suān)性洗脫(tuō)液(yè)中會(huì)容(róng)易(yì)導致一些(xiē)蛋白(bái)失(shī)去(qù)活(huó)性。

(c)為了(liǎo)獲得最大(dà)的(dí)洗(xǐ)脫效(xiào)率，可(kě)重(zhòng)復步驟(zhòu)(a)和(b)，並(bìng)將(jiāng)相(xiāng)同(tóng)樣品(pǐn)合(hé)並(bìng)。

(d)洗(xǐ)脫(tuō)並中和的Flag標簽蛋白及其復合物(wù)置(zhì)於(yú)4℃待(dài)用，或者-20℃或-80℃長期保(bǎo)存(cún)。

相關(guān)文獻：

[1] Yujuan Zhan, Qiugu Chen, Yue Song, Xianli Wei, Tingxiu Zhao, Bonan Chen, Chengxi Li, Wenbo Zhang, Yanjun Jiang, Yuhui Tan, Biaoyan Du, Jianyong Xiao, Kun Wang.Berbamine Hydrochloride inhibits lysosomal acidification by activating Nox2 to potentiate chemotherapy-induced apoptosis via the ROS-MAPK pathway in human lung carcinoma cells

Cell Biol Toxicol. 2023 Aug;39(4):1297-1317. doi: 10.1007/s10565-022-09756-8. (IF 6.284)

[2] Linhong Liao, Hui Cheng, Shusong Liu.Non-SMC condensin I complex subunit H promotes the malignant progression and cisplatin resistance of breast cancer MCF-7 cells Oncol Lett. 2022 Jul 19;24(3):317. doi: 10.3892/ol.2022.13438. (IF 2.311)

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