為了排除(chú)某些(xiē)因素對PCR結果的影(yǐng)響，PCR實驗(yàn)需要(yào)對照實(shí)驗。PCR的陽(yáng)性對照(zhào)是(shì)Marker，推(tuī)測(cè)PCR產(chǎn)物長(cháng)度(dù)，判斷(duàn)PCR產(chǎn)物是否是(shì)目(mù)的(dí)片段(duàn)。PCR的陰性對(duì)照(zhào)是PCR的(dí)空白管(guǎn)，除了模(mó)板不加之外，其成分(fēn)與(yǔ)其(qí)他管(guǎn)一樣(yàng)，證明沒有其(qí)他模(mó)板(bǎn)汙(wū)染。下麵(miàn)讓(ràng)我們一(yī)起(qǐ)來看看PCR和凝(níng)膠電泳(yǒng)實驗結果常見的問題及(jí)原(yuán)因分(fēn)析(xī)吧(bā)！
 

　　一(yī)，耗(hào)材選(xuǎn)擇(zé)不(bù)當對實驗結果造成很大的(dí)影響
 

　　PCR耗(hào)材一般都是聚(jù)丙烯(PP)材質(zhì)，因(yīn)其為(wéi)生(shēng)物學惰(duò)性材(cái)料(liào)，表(biǎo)麵不易於(yú)粘(nián)附生(shēng)物(wù)分(fēn)子，且(qiě)有著(zhuó)良(liáng)好(hǎo)的化學耐性(xìng)，及溫度(dù)耐(nài)受(shòu)性。這些材(cái)料通常會與(yǔ)試(shì)劑(jì)或(huò)者(zhě)樣(yàng)品(pǐn)直接(jiē)接(jiē)觸(chù)，因(yīn)而在(zài)生(shēng)產製備(bèi)過程中需要(yào)選用(yòng)高質量(liáng)的材料和(hé)良好的加工工(gōng)藝。
 

　　PCR管的(dí)體積(jī)大多數都(dū)可(kě)以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足(zú)實驗要求(qiú)的(dí)基(jī)礎上，優(yōu)先(xiān)推(tuī)薦(jiàn)選(xuǎn)用(yòng)低容管。因為低(dī)容反(fǎn)應(yīng)管有(yǒu)著(zhuó)較小(xiǎo)的上方空(kōng)間，可提(tí)高熱(rè)傳(chuán)導率並降低(dī)蒸(zhēng)發(fā)。而且(qiě)在加(jiā)樣時(shí)，需要避免加(jiā)樣(yàng)過量(liáng)或過(guò)少(shǎo)。過(guò)量會導(dǎo)致熱(rè)傳導率(shuài)下降(jiàng)，溢(yì)出及交(jiāo)叉(chā)汙(wū)染，而加樣過少(shǎo)可(kě)能會(huì)造成樣(yàng)品蒸(zhēng)發損失。
 

　　二，假(jiǎ)陰(yīn)性(無(wú)擴(kuò)增(zēng)產(chǎn)物)——現(xiàn)象：陽(yáng)性(xìng)對照有條帶(dài)，而樣品則無
 

　　原(yuán)因：模(mó)板(bǎn)含有(yǒu)抑製物，含(hán)量低；緩(huǎn)衝液(Buffer)對樣品(pǐn)不合(hé)適；引(yǐn)物設計不當或(huò)者發(fā)生降(jiàng)解(jiě)；反應(yīng)條件：退(tuì)火溫(wēn)度(dù)太高，延(yán)伸時間太(tài)短。
 

　　對(duì)策(cè)：純化模板(bǎn)或者(zhě)使用試劑盒提(tí)取(qǔ)模板(bǎn)DNA或加大模板的用(yòng)量(liáng)；更換Buffer或調整濃度；重新設計引物(避免鏈間二聚(jù)體和(hé)鏈內二(èr)級(jí)結構)或(huò)者換(huàn)一管新引物；降(jiàng)低(dī)退(tuì)火(huǒ)溫(wēn)度，延(yán)長延伸時間(jiān)。
 

　　三(sān)，非特(tè)異(yì)性擴增——條帶與預計的大小(xiǎo)不一(yī)致或者(zhě)非(fēi)特異性擴增帶(dài)
 

　　原因：引(yǐn)物的(dí)特異性不強(qiáng)，提取模(mó)板DNA中可能(néng)會有非(fēi)靶基因性(xìng)同源序(xù)列；模(mó)板或引(yǐn)物濃度(dù)過高；酶量過(guò)多；Mg2+濃(nóng)度(dù)偏(piān)高(gāo)；退火溫(wēn)度偏低；循環次數(shù)過多(duō)。
 

　　對(duì)策(cè)：重(zhòng)新設計引(yǐn)物；適當降(jiàng)低模(mó)板(bǎn)或引物(wù)濃(nóng)度；適當減(jiǎn)少酶量(liáng)；降低鎂離子濃度；適(shì)當提高退火溫度則減少(shǎo)與同(tóng)源(yuán)性非靶(bǎ)DNA的互(hù)補(bǔ)程度；減(jiǎn)少循環次(cì)數。四，拖尾——產(chǎn)物(wù)在凝膠上呈模糊不(bù)清狀態(tài)(彌散(sàn))
 

　　原因：模(mó)板不(bù)純；引(yǐn)物(wù)濃度不夠優化；Buffer不(bù)合(hé)適；退火溫(wēn)度(dù)偏(piān)低；酶量(liáng)過(guò)多(duō)；dNTP，Mg2+濃(nóng)度偏高；循(xún)環(huán)次數(shù)過(guò)多(duō)。
 

　　對策(cè)：純化模板；對(duì)引(yǐn)物進行(háng)梯(tī)度稀(xī)釋(shì)；更換Buffer；適當(dāng)提(tí)高退火(huǒ)溫度(dù)；適(shì)量用酶；適當(dāng)降低(dī)dNTP和鎂離(lí)子(zǐ)的濃(nóng)度；減少循(xún)環(huán)次(cì)數。
 

　　更(gēng)多有關PCR和凝膠電泳(yǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果常(cháng)見(jiàn)的(dí)問題及原因(yīn)分析，請(qǐng)聯(lián)係(xì)天(tiān)津益元利康生物科(kē)技有限公(gōng)司！