一，產(chǎn)品背(bèi)景

在研究項目中，當(dāng)向外(wài)部來源(yuán)運(yùn)送樣本(běn)或(huò)從外(wài)部來源運送樣(yàng)本時(shí)，或(huò)者(zhě)需(xū)要(yào)在(zài)不同(tóng)時間收集(jí)樣本時，或者(zhě)僅僅是當樣本不(bù)能一(yī)次(cì)全部處理時(shí)，通(tōng)常需(xū)要(yào)儲存新鮮(xiān)器官和固(gù)體(tǐ)組(zǔ)織(zhī)樣本(běn)。在(zài)這些情(qíng)況下(xià)，短(duǎn)期儲(chǔ)存可以充(chōng)分(fēn)靈活地在幾(jī)天內對(duì)組織(zhī)進行(háng)進(jìn)一步處(chǔ)理。為(wéi)了從儲存(cún)的組(zǔ)織(zhī)中分離活細胞(bāo)，必須(xū)避免在(zài)儲存期(qī)間出(chū)現(xiàn)壞(huài)死和凋(diāo)亡。此外，必須(xū)防止(zhǐ)細胞(bāo)活(huó)化，以及(jí)細胞(bāo)多能(néng)性的變化，以(yǐ)保(bǎo)持(chí)細胞的(dí)生理(lǐ)和功(gōng)能狀(zhuàng)態。一(yī)種(zhǒng)常見的儲存方法(fǎ)是冷(lěng)凍組織(zhī)樣(yàng)本，但(dàn)這經常(cháng)導(dǎo)致(zhì)解凍(dòng)後(hòu)的(dí)細(xì)胞死(sǐ)亡率(shuài)很(hěn)高(gāo)，並且(qiě)對運(yùn)輸(shū)構成挑(tiāo)戰(zhàn)。

為了(liǎo)克服所(suǒ)有(yǒu)這些(xiē)問(wèn)題(tí)，美(měi)天(tiān)旎專(zhuān)門(mén)開發(fā)了(liǎo)MACS組織(zhī)保存(cún)液，它可以在2-8°C下將新(xīn)鮮固(gù)體(tǐ)組織最佳儲存至(zhì)少(shǎo)48小(xiǎo)時。在(zài)此存儲期(qī)內，細胞的活力，功(gōng)能和激活狀態(tài)得(dé)以保(bǎo)存，並防(fáng)止細胞(bāo)應激(jī)相關基因(yīn)的(dí)誘(yòu)導。MACS組織保(bǎo)存液已(yǐ)經過多種人類和(hé)小鼠組織(zhī)的(dí)測試，包(bāo)括腫瘤，肺，脾(pí)，腦和骨骼肌。

二(èr)，材(cái)料(liào)與方(fāng)法

1. 腫瘤儲(chǔ)存

收集小鼠CT26腫瘤並切成(chéng)大(dà)小(xiǎo)相(xiāng)似(sì)的塊。將(jiāng)等量的腫(zhǒng)瘤切片(piàn)分(fēn)別放入裝有5 mL MACS組織保(bǎo)存(cún)液的兩(liǎng)個(gè)15 mL試管中，於2-8℃保存24和48小時(shí)。在每(měi)個(gè)zhi定(dìng)的時間點，新(xīn)鮮(xiān)和儲存的腫(zhǒng)瘤片以(yǐ)相同的方式處理。

2. 腫瘤分(fēn)離

使用帶加熱(rè)器的gentesmacs™ Octo解(jiě)離器和(hé)Tumor Dissociation Kit, mouse根(gēn)據說明(míng)書解離腫瘤。解離(lí)後，獲得(dé)的單(dān)細胞懸浮液(yè)使(shǐ)用MACS Smart Strainers(70µm)過濾(lǜ)。其(qí)中一部分細胞(bāo)用(yòng)於(yú)流(liú)式細(xì)胞(bāo)術分析，其餘細胞(bāo)保存在RLT緩衝液(yè)(Qiagen)中，待進一步處理用(yòng)於基(jī)因表(biǎo)達(dá)分析。

3. 流(liú)式細(xì)胞(bāo)術分析(xī)

使用(yòng)以下抗(kàng)小(xiǎo)鼠RE Afinity®抗體(tǐ)流(liú)式細(xì)胞(bāo)術(shù)分析TIL群(qún)體:CD45 (REA737)，CD3 (REA614)，CD25 (REA568)，CD69 (REA937)，CD4 (REA604)，CD8a (REA601)，CD19 (REA749)，CD80 (REA983)和(hé)CD86 (REA1190)。使(shǐ)用MACSQuant®Analyzer 10對樣品(pǐn)進(jìn)行分(fēn)析。碘化(huà)丙啶用於(yú)排除死細胞(bāo)。死(sǐ)細胞(bāo)排除後，從(cóng)門控(kòng)CD45+活細(xì)胞中分析TIL群體(tǐ)。

4. 基(jī)因表達分析(xī)

使用RNeasy®Mini Kit (Qiagen)從新鮮和(hé)儲(chǔ)存(cún)的細胞中分離RNA。使用(yòng)Qiagen公司的RT2第一鏈試(shì)劑(jì)盒(hé)(RT2 First Strand Kit, Qiagen)生(shēng)成(chéng)cDNA，並使用Qiagen公司的RT2 Profiler®PCR陣列(liè)(Stress and Toxicity PathwayFinder®，小(xiǎo)鼠(shǔ))和(hé)GeneGlobe®分(fēn)析工具分析(xī)基因表達(dá)。

三，結果

MACS組織(zhī)保存液(yè)可保存(cún)細胞活(huó)力和TIL群體(tǐ)組(zǔ)成(chéng)長(cháng)達48小(xiǎo)時，CT26腫(zhǒng)瘤在收集當(dāng)天或在MACS組(zǔ)織保存液中(zhōng)儲(chǔ)存24和48小時(shí)後(hòu)處(chǔ)理(lǐ)。分離後(hòu)，流(liú)式細胞術分(fēn)析TILs的(dí)總(zǒng)細胞活力和組(zǔ)成。在新鮮(xiān)和儲存的樣(yàng)品中(zhōng)，細(xì)胞活力(lì)均超過(guò)85%(圖(tú)1A)。此(cǐ)外，TILs的(dí)組成(chéng)也隨著時間(jiān)的推移而保持不變(圖1B)。通過(guò)分(fēn)析活化標記CD25，CD69，CD80和(hé)CD86在特定(dìng)TIL群體中(zhōng)的表(biǎo)達，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活(huó)化狀態也得(dé)以(yǐ)保存(cún)。

圖1:CT26小鼠(shǔ)腫(zhǒng)瘤在MACS組(zǔ)織中4°C保存

儲存液24或48 h。解離後，流式細(xì)胞術分析細胞(bāo)總(zǒng)活(huó)力(A)和TIL組成(B)。細胞(bāo)頻率參照活(huó)細胞CD45⁺。另(lìng)外(wài)，CD3⁺和CD19⁺細(xì)胞子集的頻率分別指對應的親本(běn)CD3⁺和CD19⁺群體。

在(zài)MACS組織保存液中，細胞(bāo)應(yīng)激相(xiāng)關基(jī)因(yīn)的(dí)表達被(bèi)阻止(zhǐ)，分(fēn)子(zǐ)分析的主要(yào)關注點(diǎn)是儲存條件誘導細(xì)胞應(yīng)激和基因表達的(dí)變化。這(zhè)是(shì)通(tōng)過(guò)分析細胞應(yīng)激途(tú)徑相關(guān)基因的表達來(lái)研(yán)究(jiū)的。將儲存樣(yàng)品的基因表(biǎo)達與新(xīn)鮮(xiān)樣(yàng)品進(jìn)行比較。在(zài)儲存24或48小(xiǎo)時(shí)後，細胞中未(wèi)觀察到(dào)細胞應激相關(guān)基因的(dí)表(biǎo)達發(fā)生重大變化，基因表(biǎo)達(dá)與新鮮(xiān)樣品細胞(bāo)相當(圖(tú)2)。

圖2:新鮮腫(zhǒng)瘤(liú)和(hé)儲(chǔ)存腫(zhǒng)瘤細胞(bāo)中細(xì)胞(bāo)應(yīng)激相(xiāng)關基因(yīn)的(dí)表(biǎo)達(dá)情況(kuàng)。從新鮮和儲(chǔ)存(cún)的(dí)CT26腫(zhǒng)瘤細胞中分(fēn)離RNA，分析細胞應激相關基因的表(biǎo)達。熱圖顯(xiǎn)示了與新(xīn)鮮(xiān)組織(zhī)相比表達率的倍(bèi)增(zēng)變(biàn)化。

四，結(jié)論(lùn)

•  MACS組織保(bǎo)存液是(shì)一(yī)種*而(ér)方便的(dí)解決方(fāng)案，適用於(yú)不同(tóng)組織(zhī)樣品和(hé)器官(guān)的短期儲(chǔ)存(cún)。

•  細胞(bāo)活(huó)力，細(xì)胞成分和(hé)細胞(bāo)激活狀態可保存至(zhì)少48小時。

•  最(zuì)後，MACS組織保(bǎo)存液(yè)可以(yǐ)防(fáng)止細胞(bāo)應激(jī)反應，因為(wéi)與新鮮(xiān)樣品(pǐn)材(cái)料相比，細(xì)胞(bāo)應激(jī)相(xiāng)關基(jī)因(yīn)表達(dá)水平的(dí)變化保持(chí)在(zài)最(zuì)di水(shuǐ)平(píng)。

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