一，LNA的介紹

鎖(suǒ)核(hé)酸(suān)（Locked nucleic acid，LNA）是一(yī)種經過修飾的RNA，LNA中一(yī)部分(fēn)核糖(táng)上(shàng)的(dí)2'與(yǔ)4'碳連(lián)結在一起。一般可(kě)見於A-DNA或RNA。這(zhè)類(lèi)核(hé)酸可(kě)以(yǐ)增(zēng)加引物或(huò)探針（probe）的(dí)融解(jiě)溫度（Tm值(zhí)），加強(qiáng)這些(xiē)實驗用物(wù)質的(dí)穩(wěn)定(dìng)性，可應(yīng)用在(zài)即時聚(jù)合酶連鎖反(fǎn)應（real-time PCR）等(děng)技(jì)術中。近(jìn)期(qī),鎖(suǒ)核(hé)酸(suān)(locked nucleic acid,LNA)作為(wéi)一種新(xīn)穎的(dí)核苷(gān)酸衍生(shēng)物在(zài)藥(yào)學研究領域引(yǐn)起了(liǎo)人(rén)們(mén)的廣(guǎng)泛(fàn)關注,有希望(wàng)成為分子水平治療各(gè)種疾病(bìng)的(dí)新(xīn)突破口(kǒu).它(tā)是一種特殊的雙(shuāng)環(huán)狀核苷(gān)酸(suān)衍(yǎn)生物,結構中(zhōng)含有一個(gè)或多(duō)個2 ′-O,4′-C-亞(yà)甲基-β-D-呋喃(nán)核糖(táng)核酸單體(tǐ),核糖的2′-O位(wèi)和4′-C位通(tōng)過(guò)不同(tóng)的縮水作用(yòng)形成(chéng)氧亞(yà)甲(jiǎ)基(jī)橋(qiáo)，硫(liú)亞(yà)甲基橋或胺亞(yà)甲(jiǎ)基橋,並連接(jiē)成(chéng)環(huán)形,這個環(huán)形橋(qiáo)鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型(xíng)的N構型(xíng),降(jiàng)低了核(hé)糖結(jié)構(gòu)的柔韌(rèn)性,增加了(liǎo)磷酸(suān)鹽骨架局部結構(gòu)的(dí)穩定性(xìng).由於LNA與(yǔ)DNA/RNA在(zài)結構(gòu)上(shàng)具(jù)有(yǒu)相同(tóng)的磷(lín)酸鹽(yán)骨(gǔ)架,故其對(duì)DNA，RNA有很(hěn)好的識(shí)別能力和*的親和(hé)力.與其他寡(guǎ)核苷酸(suān)類(lèi)似物(wù)相比,LNA有(yǒu)很(hěn)多(duō)優點:a.和DNA，RNA互補的(dí)雙(shuāng)鏈有很(hěn)強的熱穩定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶(méi)降解(jiě)的(dí)穩定性;c.LNA-DNA雜交(jiāo)物能(néng)激(jī)活RNase H;d.水(shuǐ)溶(róng)性好,自(zì)由(yóu)穿入細胞膜,易被(bèi)機(jī)體吸(xī)收(shōu);e.體內無(wú)毒性(xìng)作(zuò)用(yòng);f.高(gāo)效(xiào)的自(zì)動寡聚化(huà)作(zuò)用(yòng),合(hé)成方法(fǎ)相對簡(jiǎn)單,部(bù)分或wanquan修(xiū)飾的(dí)LNA寡核(hé)酸(suān)鏈可用氨(ān)基磷酸法(fǎ)在(zài)DNA自(zì)動(dòng)合成儀上(shàng)合成。

二(èr)，LNA在(zài)基(jī)因(yīn)檢測中的應(yīng)用

1. LNA引(yǐn)物

用鎖核酸修飾引物大(dà)大提高了PCR的效(xiào)率(shuài)。PCR上遊引(yǐn)物(wù)的3'末端(duān)經(jīng)LNA修飾後，若3"末端與模(mó)板(bǎn)不是(shì)互補的(dí)，則PCR擴增效率(shuài)明顯(xiǎn)降低，即(jí)LNA修飾的引物(wù)其識別錯配的(dí)能(néng)力(lì)與(yǔ)DNA引物(wù)相比(bǐ)大大(dà)提高(gāo)。普通PCR實驗(yàn)也證明LNA引物可(kě)產(chǎn)生(shēng)較少的錯(cuò)配(pèi)產物(wù)，而DNA引物與模板發(fā)生錯配(pèi)時(shí)卻(què)有(yǒu)大量的錯誤(wù)產物(wù)擴增出(chū)。與普通的DNA引(yǐn)物(wù)相比，LNA引(yǐn)物(wù)所(suǒ)用聚合酶用量(liáng)少,成本效率(shuài)高。除此(cǐ)之外(wài),LNA引物還可(kě)以(yǐ)減(jiǎn)少模板用(yòng)量。研究(jiū)發現(xiàn)，在引物中(zhōng)間(jiān)修飾(shì)一個或三個鎖(suǒ)核酸效果最(zuì)jia。將鎖核酸修(xiū)飾(shì)在(zài)引物(wù)的3'端(duān)或5 '端(duān)或(huò)其(qí)他(tā)的(dí)位點,PCR結果(guǒ)顯示(shì)，鎖核(hé)酸(suān)修(xiū)飾在引物5'端優勢更(gēng)明顯。

2.LNA探(tàn)針

LNA(Locked Nucleic Acid)探針(zhēn)是一種(zhǒng)用(yòng)於核(hé)酸檢(jiǎn)測和分析(xī)的(dí)高效(xiào)探(tàn)針，具(jù)有增強(qiáng)的(dí)特(tè)異性和穩定(dìng)性(xìng)。它們(mén)通常(cháng)被用於實(shí)時(shí)聚合酶鏈式反(fǎn)應(yīng)(real-time PCR)，原(yuán)位雜交(jiāo)，基因表達分(fēn)析(xī)等核(hé)酸(suān)分子(zǐ)生(shēng)物學技(jì)術中。LNA探針的(dí)特(tè)殊之處(chǔ)在(zài)於它們(mén)的(dí)核酸(suān)結構中包(bāo)含(hán)了(liǎo)Locked Nucleic Acid,即(jí)一種(zhǒng)經(jīng)過修飾(shì)的核酸單(dān)元(yuán)。LNA中(zhōng)的核(hé)苷酸具有特殊(shū)的(dí)構象(xiàng)，其中(zhōng)的核苷酸環(huán)被修(xiū)飾以形(xíng)成一種(zhǒng)特(tè)殊的結構(gòu)，使其(qí)能夠更(gēng)強(qiáng)烈地結合目(mù)標DNA或RNA。在基因(yīn)表達分析(xī)中，LNA探(tàn)針可用(yòng)於檢測(cè)特(tè)定(dìng)基(jī)因的表(biǎo)達水(shuǐ)平(píng)。通過(guò)與(yǔ)目(mù)標基(jī)因雜交，LNA探針(zhēn)能夠準(zhǔn)確地檢測出基因的(dí)表達量(liáng)，從而幫助(zhù)研(yán)究人(rén)員(yuán)確定(dìng)基因的表達模式。這有助(zhù)於揭示基(jī)因(yīn)的(dí)功能和(hé)疾病的發(fā)生(shēng)機(jī)製。突(tū)變檢測(cè)是(shì)LNA探(tàn)針應用的另一個(gè)重(zhòng)要領域(yù)。LNA探(tàn)針可(kě)以與目標(biāo)DNA序列進行高(gāo)親(qīn)和力結(jié)合，從而準確地(dì)檢測出突變的存在。這(zhè)有助於(yú)對(duì)疾病進(jìn)行早(zǎo)期診斷(duàn)和治療方(fāng)案的(dí)製定(dìng)。LNA探針還(huán)可(kě)以(yǐ)用(yòng)於(yú)基(jī)因(yīn)定位和疾病診斷(duàn)。通(tōng)過(guò)與(yǔ)染色(sè)體雜(zá)交(jiāo)，LNA探針可(kě)以準確(què)地(dì)檢測和定位特(tè)定基因或(huò)染色體片段(duàn)。這(zhè)有(yǒu)助(zhù)於確定(dìng)基因(yīn)的(dí)位置(zhì)和功能(néng)，同(tóng)時也有助於疾病的(dí)診斷和治療(liáo)。

提高(gāo) qPCR 探針(zhēn)的熱(rè)穩定(dìng)性。摻入LNA核苷(gān)酸後，由(yóu)於LNA在錯(cuò)配(pèi)位點(diǎn)形成Watson-Crick鹼(jiǎn)基對(duì)的傾(qīng)向更強烈，因此qPCR探針通過單(dān)核(hé)苷酸多(duō)態(tài)性（SNP）區(qū)分(fēn)等(děng)位基(jī)因(yīn)的能力會大(dà)大增強。熱變(biàn)性研究表明，當(dāng)LNA 摻(chān)入在寡核(hé)苷酸的(dí)特定(dìng)位置時，完(wán)mei匹(pǐ)配(pèi)和(hé)錯(cuò)配(pèi)之間的 Tm 值(zhí)存在顯(xiǎn)著差(chà)異。因此，在 SNP 測定(dìng)中，與(yǔ)天(tiān)然狀(zhuàng)態DNA探(tàn)針(zhēn)相(xiāng)比，LNA qPCR探針雜交具有更強的不穩定(dìng)性，因(yīn)此能(néng)夠(gòu)更(gēng)好地區(qū)分(fēn)出錯配。

由於可(kě)以使(shǐ)用LNA調(tiáo)整qPCR探針的Tm值(zhí)，因此(cǐ)可(kě)以(yǐ)獲(huò)得(dé)具有不同(tóng)GC 含(hán)量(liáng)的幾個(gè)短序列(liè)的(dí)標準化Tm值(zhí)。例如，富含(hán)AT的(dí)天然(rán)狀(zhuàng)態(tài)DNA qPCR探針(zhēn)通常需(xū)要超過(guò)30個鹼基(jī)長（有(yǒu)時需要(yào)超(chāo)過 40個）以滿(mǎn)足擴(kuò)增(zēng)子設(shè)計(jì)指(zhǐ)南，但(dàn)仍有(yǒu)可能表現(xiàn)不佳(jiā)。使用LNA qPCR探針(zhēn)，通(tōng)過(guò)選(xuǎn)擇性定 位LNA核苷酸，有助(zhù)於產生(shēng)最佳(jiā)的(dí)，具有(yǒu)高(gāo)度(dù)特異(yì)性(xìng)的(dí)短探(tàn)針。較窄的Tm值範(fàn)圍對於(yú)微陣(zhèn)列和(hé)多重PCR應(yīng)用特(tè)別有益，特(tè)別(bié)是當(dāng)探針(zhēn)必須在相(xiāng)同條(tiáo)件(jiàn)下與(yǔ)許多不同靶標的同時結合時(shí)。