ROS在(zài)細(xì)胞生命，應激(jī)和死亡中(zhōng)具介(jiè)導(dǎo)作(zuò)用(yòng)，今天讓(ràng)我(wǒ)們來(lái)聊(liáo)下ROS吧~

一(yī)
，ROS簡介(jiè)

活(huó)性(xìng)氧(yǎng)（reactive oxygen species，ROS）廣(guǎng)泛指代氧來(lái)源(yuán)的自由基和非自(zì)由(yóu)基，包含(hán)了超氧(yǎng)陰離(lí)子(zǐ)（O2-）
，*（H2O2）
，羥(qiǎng)自由基（OH-）
，臭(chòu)氧(yǎng)（O3）和單綫(xiàn)態(tài)氧（1O2），由(yóu)於它們含(hán)有(yǒu)不成(chéng)對的(dí)電子，因而具有很高的化(huà)學反應活(huó)性。

在(zài)機體內(nèi)，ROS的主要(yào)來源(yuán)之一(yī)是(shì)綫(xiàn)粒(lì)體內膜(mó)的呼吸(xī)鏈底物端，在綫粒(lì)體(tǐ)中的(dí)電子(zǐ)傳(chuán)遞鏈復合物將(jiāng)電子(zǐ)傳遞給O2的過程中，有一(yī)部分O2被(bèi)還(huán)原，形成(chéng)O2-或H2O2。其(qí)中(zhōng)，最為(wéi)重要的是O2-，它是大部分(fēn)的(dí)ROS的前體，主要由綫(xiàn)粒(lì)體內膜(mó)呼(hū)吸鏈(liàn)中(zhōng)的蛋白酶(méi)復合體Ⅰ
，Ⅲ產生。這部分作為代謝副產(chǎn)物的ROS長(cháng)期被(bèi)當(dāng)作損傷生物大(dà)分(fēn)子的毒性(xìng)分子，但近年來(lái)被認(rèn)為在較低水(shuǐ)平(píng)時(shí)作為(wéi)一(yī)類信號小(xiǎo)分子(zǐ)具有生理(lǐ)作(zuò)用(yòng)，另一(yī)個(gè)ROS的重要來(lái)源(yuán)是(shì)NADPH化酶(méi)，其催(cuī)化亞(yà)基(jī)被稱(chēng)為NADPH氧(yǎng)化(huà)酶(méi)2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能夠在細(xì)胞質膜(mó)上表達。在不(bù)同的(dí)組織中已經鑒(jiàn)定了(liǎo)6種NOX-2的(dí)同瀝物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，統(tǒng)稱(chēng)為(wéi)NOX家族蛋(dàn)白(bái)。這些(xiē)酶(méi)能通過質傳遞電子(zǐ)產生ROS，可以大(dà)量(liáng)存(cún)在(zài)於(yú)吞噬細胞，也在其(qí)他(tā)各種組(zǔ)織細胞中(zhōng)以(yǐ)較低水平普遍(biàn)存(cún)在，參(cān)與很(hěn)多(duō)膜受體下(xià)遊信(xìn)號(hào)激(jī)活(huó)。

ROS保護(hù)細胞(bāo)免受(shòu)病原體的(dí)侵(qīn)害，但較高(gāo)濃度的ROS會誘(yòu)發許(xǔ)多(duō)疾病，例(lì)如惡性腫瘤(liú)，糖尿病(bìng)，關節炎，動脈(mài)粥(zhōu)樣硬化(huà)，心髒病(bìng)並增(zēng)強衰(shuāi)老過程。

二(èr)
，檢(jiǎn)測(cè)方(fāng)法

目(mù)前有(yǒu)多(duō)種方法用(yòng)於檢測(cè)ROS，包括(kuò)熒光染色法
，電子順磁共振(zhèn)技(jì)術（EPR）
，化學(xué)發光法
，色譜法
，分光光度法(fǎ)
，電(diàn)化學(xué)生物傳感器(qì)以(yǐ)及基(jī)於熒光蛋(dàn)白等(děng)七(qī)種。在(zài)這(zhè)裏(lǐ)，我(wǒ)們將著(zhuó)重介(jiè)紹熒光染色法(fǎ)，以(yǐ)及其在檢(jiǎn)測細(xì)胞(bāo)內ROS時的原理和操作步(bù)驟(zhòu)。

檢測(cè)原(yuán)理(lǐ)

目(mù)前，用(yòng)於檢(jiǎn)測(cè)細胞內ROSzuiguang泛采用的方法(fǎ)是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒(yíng)光黃雙乙酸鹽）是一(yī)種可指(zhǐ)示(shì)的探(tàn)針(zhēn)，其(qí)本身(shēn)不具有(yǒu)熒(yíng)光(guāng)，但(dàn)可(kě)以自由(yóu)穿(chuān)過細胞膜。一旦(dàn)進入細胞，它會被細(xì)胞(bāo)內(nèi)的(dí)酯酶水解成DCFH。由(yóu)於DCFH無法穿(chuān)過(guò)細(xì)胞(bāo)膜(mó)，因(yīn)此(cǐ)熒光探針會在(zài)細胞(bāo)內(nèi)積(jī)聚。細胞內的ROS能夠(gòu)氧化(huà)無熒光的DCFH，生(shēng)成有(yǒu)熒光的DCF，且(qiě)熒(yíng)光(guāng)強度與ROS水平成正比。通過熒(yíng)光顯微(wēi)鏡(jìng)
，流(liú)式(shì)細(xì)胞儀(yí)或激光(guāng)共聚(jù)焦顯微鏡等(děng)設備，在(zài)最大激發波(bō)長480nm和最大發(fā)射(shè)波長(cháng)525nm下檢測熒(yíng)光信號。

檢(jiǎn)測步驟(zhòu)：

1.裝載(zǎi)探(tàn)針

1）先用無(wú)血清培(péi)養(yǎng)基稀(xī)釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup,100mM）到常用(yòng)工作(zuò)濃度100μM，對(duì)於(yú)刺激(jī)時間(jiān)較短的細胞(bāo)，先裝載探針(zhēn)，後用活(huó)性氧陽性(xìng)對(duì)照(zhào)（Rosup）或(huò)自己(jǐ)感(gǎn)興趣的藥(yào)物(wù)刺激細胞。

2）對於刺(cì)激時(shí)間較(jiào)長(cháng)的細(xì)胞(bāo)，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照（Rosup）或(huò)自(zì)己感興趣的藥物刺激細胞，後裝載探(tàn)針(zhēn)。

1.1原(yuán)位(wèi)裝載(zǎi)探(tàn)針（本(běn)方法僅適(shì)用於貼(tiē)壁細(xì)胞）

1）細胞準備：檢(jiǎn)測前(qián)一天進(jìn)行(háng)細(xì)胞鋪板，確(què)保(bǎo)檢(jiǎn)測時(shí)細(xì)胞(bāo)密度(dù)達到(dào)50~70%。

2）誘(yòu)導(dǎo)：去除細(xì)胞(bāo)培養(yǎng)液，加(jiā)入(rù)適量經合適的緩衝液(yè)或無血清培養基稀釋(shì)到(dào)工作(zuò)濃度的(dí)藥物，於37℃細(xì)胞培(péi)養箱內避光孵育(yù)，具體(tǐ)誘(yòu)導時間根(gēn)據誘導物本身特(tè)性(xìng)，以及(jí)細(xì)胞類(lèi)型(xíng)來決(jué)定。

3）探針(zhēn)裝載(zǎi)：按照(zhào)1:1000用無(wú)血清培養基稀釋DCFH-DA，使終(zhōng)濃(nóng)度為(wéi)10μM。吸去(qù)誘(yòu)導用藥(yào)物，加(jiā)入適(shì)當(dāng)體(tǐ)積(jī)稀釋好的DCFH-DA工作液，以(yǐ)覆蓋住細(xì)胞為(wéi)宜。

4）細(xì)胞(bāo)清洗：用無血清培養基(jī)洗(xǐ)滌細(xì)胞1~2次(cì)，以(yǐ)充(chōng)分去(qù)除未(wèi)進入細胞(bāo)內(nèi)的(dí)DCFH-DA。

1.2收集細胞後裝載(zǎi)探針（適用於(yú)貼壁(bì)細胞(bāo)和懸浮細(xì)胞）

1）細胞準備(bèi)：按(àn)照(zhào)標(biāo)準方(fāng)法培養細(xì)胞，必(bì)須保(bǎo)證(zhèng)檢測所用細胞狀態(tài)健(jiàn)康。按照(zhào)適當方(fāng)法，清洗(xǐ)並(bìng)收集足(zú)量的細胞。

2）誘(yòu)導(dǎo)：將(jiāng)收(shōu)集(jí)好的細(xì)胞懸浮(fú)於適(shì)量(liáng)稀釋好(hǎo)的藥(yào)物(wù)，於37℃細(xì)胞(bāo)培養箱內(nèi)避光(guāng)孵育，具體誘導時間根據誘(yòu)導物(wù)本(běn)身特(tè)性，以及(jí)細胞類型來決(jué)定。

3）探針裝(zhuāng)載(zǎi)：離心去(qù)除上(shàng)清，收(shōu)集(jí)細(xì)胞(bāo)，加入濃度(dù)為(wéi)10μM的(dí)DCFH-DA探(tàn)針，以(yǐ)覆(fù)蓋住細(xì)胞(bāo)為宜。

4）細胞清洗：用無(wú)血清(qīng)細(xì)胞培(péi)養基洗滌細(xì)胞1~2次(cì)，以充(chōng)分去(qù)除(chú)未進入細(xì)胞(bāo)內的(dí)DCFH-DA。
2.檢測(cè)

1）原位(wèi)裝載(zǎi)探針法(fǎ)：激(jī)光共聚焦(jiāo)顯微鏡(jìng)直接觀察(chá)，或收(shōu)集(jí)細胞後(hòu)用熒(yíng)光(guāng)分光光度計(jì)
，熒(yíng)光(guāng)酶標(biāo)儀(yí)或(huò)流式(shì)細胞儀(yí)檢(jiǎn)測。

2）收(shōu)集(jí)細(xì)胞後裝(zhuāng)載探針(zhēn)：用熒(yíng)光分(fēn)光(guāng)光度計
，熒光酶(méi)標(biāo)儀或(huò)流(liú)式(shì)細胞(bāo)儀檢(jiǎn)測，也可以用(yòng)激(jī)光(guāng)共聚(jù)焦顯(xiǎn)微鏡直(zhí)接觀(guān)察(chá)。