一，PCR結(jié)果(guǒ)分(fēn)析的基本步驟：‌

1.基綫(xiàn)設置‌：實時PCR反應的(dí)基綫是指(zhǐ)在(zài)PCR的初始循環(huán)期間的(dí)信號水平，通(tōng)常是3至(zhì)15個(gè)循環(huán)之間，此時熒光信號(hào)幾(jī)乎(hū)沒有(yǒu)變化，可(kě)以認為是背景(jǐng)或反應(yīng)的噪音(yīn)
。

2. ‌閾值設定(dìng)‌：‌qPCR的閾值(zhí)代表(biǎo)的(dí)是(shì)明顯(xiǎn)超出(chū)基綫(xiàn)的(dí)擴(kuò)增信號(hào)水(shuǐ)平，用以(yǐ)區(qū)分明確的擴增(zēng)信號和背景
。通常qPCR儀器自帶(dài)軟件會自動將閾(yù)值設置為(wéi)基綫熒(yíng)光(guāng)值(zhí)標(biāo)準(zhǔn)偏差的(dí)10倍
。

3. ‌CT值(zhí)計算‌：Ct是(shì)指(zhǐ)熒光信號(hào)超過(guò)閾值時(shí)對應的循(xún)環(huán)數，Ct值(zhí)與(yǔ)目的基因的起始(shǐ)量成反比，可用(yòng)於(yú)計算(suàn)DNA初始拷(kǎo)貝數
。

4. ‌擴增曲(qū)綫分析(xī)‌：擴(kuò)增曲(qū)綫有兩(liǎng)種展現形式(shì)，一種(zhǒng)是(shì)綫性，一(yī)種是(shì)對數(shù)形(xíng)式(shì)
。通(tōng)常用(yòng)CT來(lái)推算(suàn)樣(yàng)品中(zhōng)樣品(pǐn)的濃度，CT值越高(gāo)說明模板濃(nóng)度(dù)越低
。

5. ‌標準曲綫‌：將已(yǐ)知(zhī)濃度(dù)的(dí)樣品（標準(zhǔn)品）經(jīng)過(guò)梯(tī)度稀(xī)釋(shì)後分別取(qǔ)樣進行熒光(guāng)定量PCR，得(dé)到(dào)的(dí)一係列Ct值與(yǔ)Log模(mó)板數對應可以(yǐ)得到(dào)一(yī)個(gè)相(xiāng)關(guān)的曲(qū)綫，即標(biāo)準(zhǔn)曲綫
。這個標準曲(qū)綫(xiàn)可以用來判斷熒光(guāng)定量PCR體(tǐ)係的優(yōu)劣(liè)
。

6. ‌熔(róng)解曲(qū)綫分析‌：PCR產物(wù)進行逐(zhú)步升溫(wēn)監(jiān)測，可以(yǐ)看到(dào)在(zài)達到其解(jiě)鏈溫度(dù)時，熒(yíng)光(guāng)信號(hào)會(huì)有一個(gè)忽然(rán)的(dí)下降(jiàng)
。理論(lùn)上如(rú)果(guǒ)PCR得到(dào)特(tè)異性產(chǎn)物則隻有一(yī)個Tm值(zhí)，在(zài)溶(róng)解(jiě)曲(qū)綫(xiàn)上表示(shì)隻(zhī)有單(dān)峰存在
。如(rú)果(guǒ)是多相峰，可(kě)以判(pàn)斷產物不是(shì)單一(yī)的，發生了非(fēi)特異擴增
。

二，不同PCR技術(shù)的結果(guǒ)分析(xī)方法(fǎ)

1. ‌第一(yī)代PCR技術‌：采用(yòng)瓊脂(zhī)糖(táng)電(diàn)泳(yǒng)的方式(shì)對PCR產物進行分(fēn)析，通(tōng)過電泳判斷(duàn)擴增產物的大小，用於臨床檢(jiǎn)測(cè)
。

2. ‌第二代PCR技(jì)術(shù)‌：熒光(guāng)定量PCR（qPCR），通(tōng)過設(shè)置基綫(xiàn)，閾值(zhí)和CT值進行(háng)定(dìng)量分(fēn)析(xī)，適(shì)用於需要(yào)精確測量DNA或(huò)RNA含量的實驗(yàn)
。

3. ‌第三(sān)代PCR技術(shù)‌：以(yǐ)微滴化(huà)處理(lǐ)步(bù)驟(zhòu)為主(zhǔ)要特征，提(tí)高了檢(jiǎn)測的(dí)靈敏(mǐn)度和特異性(xìng)，適用於更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)需求
。

三(sān)，具體實驗操作(zuò)步驟(zhòu)

1. ‌樣(yàng)品(pǐn)處理(lǐ)‌：將(jiāng)樣品進行(háng)稀釋(shì)和離(lí)心(xīn)處(chǔ)理，確(què)保DNAwanquan裂(liè)解(jiě)和(hé)分離(lí)
。

2. ‌PCR反(fǎn)應(yīng)‌：按照試劑盒說(shuō)明(míng)書操作(zuò)，將(jiāng)反應管與(yǔ)凍(dòng)幹成(chéng)分一起離心，添加緩衝液(yè)和引物(wù)/探針/核苷(gān)酸混(hùn)合(hé)物，進(jìn)行PCR反(fǎn)應(yīng)
。

3. ‌結(jié)果分析(xī)‌：通過(guò)基(jī)綫(xiàn)，閾值，CT值(zhí)和(hé)擴增曲(qū)綫(xiàn)等參數分析PCR結(jié)果(guǒ)，比較實(shí)驗組和(hé)對照(zhào)組的(dí)差(chà)異，確定基因(yīn)表達的(dí)變(biàn)化(huà)
。

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