一
，製(zhì)備(bèi)細胞生長培養基(jī)

所使用的(dí)培養(yǎng)基(jī)將取決於所(suǒ)使(shǐ)用(yòng)的(dí)細(xì)胞(bāo)類型。例(lì)如(rú):

使用無(wú)菌技(jì)術在II級安(ān)全帽(mào)下工(gōng)作(zuò)。

二
，在(zài)顯(xiǎn)微鏡下檢(jiǎn)查(chá)細(xì)胞

在生(shēng)長(cháng)過(guò)程中，應(yīng)該每天(tiān)檢(jiǎn)查細(xì)胞，以確(què)保它(tā)們健(jiàn)康並(bìng)按預期生長。它們(mén)應該(gāi)主要附著(zhuó)在燒(shāo)瓶的(dí)底部，形(xíng)狀圓而豐滿或(huò)細長(cháng)，並在(zài)其(qí)膜周圍(wéi)折(zhē)射光綫。這表(biǎo)明(míng)他(tā)們(mén)是(shì)健康的。

介質(zhì)應該(gāi)是(shì)粉橙(chéng)色(sè)。如(rú)果(guǒ)細胞大(dà)量分離(lí)和/或(huò)看起來(lái)幹(gān)癟(biē)和顆(kē)粒狀(zhuàng)/顏(yán)色深，則丟棄(qì)細(xì)胞，不要(yào)用於(yú)檢(jiǎn)測。

三
，製(zhì)備細胞(bāo)懸(xuán)浮液

1. 所有細胞(bāo)處理和(hé)培(péi)養基(jī)製備(bèi)應在II類安全櫃中(zhōng)使(shǐ)用(yòng)無菌技術(shù)進(jìn)行。

2. 當細(xì)胞融(róng)合70-80%時(shí)，它(tā)們仍應(yīng)處於(yú)生長的對(duì)數(shù)階段(duàn)，可(kě)用(yòng)於電(diàn)鍍。

3. 首(shǒu)先(xiān)將(jiāng)培(péi)養基(jī)在37°C水浴(yù)中加熱至(zhì)少(shǎo)30分(fēn)鐘(zhōng)。

4. 準備好後，小心(xīn)地(dì)從(cóng)一個175平方(fāng)厘米(mǐ)的(dí)培養(yǎng)皿中(zhōng)倒(dǎo)入(rù)所(suǒ)需細(xì)胞(bāo)的(dí)培養(yǎng)基（含(hán)有(yǒu)實(shí)驗室(shì)消(xiāo)毒(dú)劑），注(zhù)意(yì)不要增(zēng)加任何(hé)滴入(rù)的汙染風險。

5. 立即(jí)更(gēng)換(huàn)，小心(xīn)地倒入100毫升預(yù)熱好(hǎo)的新(xīn)鮮培養基(jī)。

6. 使(shǐ)用細(xì)胞(bāo)刮板(bǎn)，輕輕(qīng)刮掉燒瓶底(dǐ)部的(dí)細(xì)胞(bāo)到培養(yǎng)基(jī)中。有些細胞(bāo)係可能需要胰(yí)蛋白酶化。在繼(jì)續之前(qián)，檢查燒(shāo)瓶底部(bù)，檢查(chá)所(suǒ)有(yǒu)的細胞(bāo)是否(fǒu)脫(tuō)落。

7. 確保待(dài)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液通過(guò)輕(qīng)搖瓶混合均匀(yún)。必要時可使用(yòng)血清(qīng)學(xué)移(yí)液(yè)管。

8. 在細(xì)胞wan全(quán)有機會沉(chén)澱之(zhī)前，使(shǐ)用血(xiě)清學(xué)移液管取出(chū)約1ml細胞(bāo)懸(xuán)液(yè)，並將其(qí)放(fàng)置(zhì)在附注管(guǎn)中(zhōng)。

9. 用(yòng)血(xiě)細胞計進行(háng)細(xì)胞計數。

四(sì)
，獲得正(zhèng)確的(dí)細(xì)胞密度

使用(yòng)下(xià)麵(miàn)的計算(suàn)得到(dào)正確(què)的細胞密度。這(zhè)應(yīng)該(gāi)是4.5 × 105個(gè)細(xì)胞/mL左(zuǒ)右，但需要根(gēn)據細(xì)胞(bāo)係進行優(yōu)化。

N = df

45 × 104

N是每毫升細胞數

DF是(shì)計算出(chū)來的稀釋(shì)係數

由於細胞(bāo)在(zài)100ml培(péi)養基(jī)中(zhōng)，接(jiē)下來的(dí)計算是
：

100 mL x稀釋因子(zǐ)

這將給(gěi)出(chū)細胞應該在的介質體積(jī)的值。

用血清學移(yí)液管加(jiā)入(rù)適量的預熱培養(yǎng)基(jī)。

例子:

如果(guǒ)細胞計數為55 × 104/mL，有100 mL細胞懸液
：

55 × 104細胞/mL = 1.22

45 × 104細胞(bāo)/mL

100毫升× 1.22 = 122毫升

因(yīn)此，對於(yú)45 × 104/mL的細胞懸浮液(yè)，在100 mL細(xì)胞懸(xuán)浮液中加入22 mL預(yù)熱(rè)培(péi)養基(jī)。

如果(guǒ)正確(què)細(xì)胞密度所(suǒ)需的體積小於100ml
：

將細(xì)胞倒入50ml離心管中。

在離心(xīn)機中以100轉/分旋(xuán)轉10分鐘，確(què)保離心機平(píng)衡。

小心地(dì)倒出上(shàng)清。

將細(xì)胞(bāo)顆粒重懸於所(suǒ)需體積的預(yù)熱培養(yǎng)基(jī)中(zhōng)。

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