qpcr結果和(hé)wb結果不(bù)一致？是什麼原因呢？今(jīn)天讓我們(mén)來探(tàn)討一(yī)下~

一，實驗(yàn)技術(shù)層麵(miàn)的(dí)原因

(1) 樣品製備(bèi)與處(chǔ)理

在(zài)qPCR中，如(rú)果(guǒ)總(zǒng)RNA樣品提取環節出(chū)現(xiàn)失誤，如取(qǔ)材到(dào)液氮(dàn)速凍(dòng)耗時過(guò)長導致RNA降(jiàng)解(jiě)，或(huò)在製樣時(shí)沒(méi)有保持低溫環境，沒有(yǒu)有效防範外(wài)源性RNA酶的汙(wū)染，都(dū)可(kě)能影響RNA的質量和(hé)qPCR結果的準確(què)性。

在WB實驗中(zhōng)，蛋白樣(yàng)品製(zhì)備(bèi)環節(jié)同(tóng)樣至關(guān)重要(yào)。如(rú)果取材到(dào)液(yè)氮速凍耗(hào)時(shí)過長(cháng)或製樣時沒(méi)有(yǒu)保持(chí)低溫環(huán)境，可(kě)能(néng)導致(zhì)蛋(dàn)白降解(jiě)。此(cǐ)外(wài)，如果沒(méi)有(yǒu)加(jiā)蛋白酶(méi)抑(yì)製(zhì)劑(jì)，也可(kě)能(néng)導(dǎo)致(zhì)蛋(dàn)白(bái)降解(jiě)。另(lìng)外，如果蛋白發(fā)生可逆性(xìng)沉澱(diàn)，如(rú)低溫保(bǎo)存(cún)時(shí)蛋白濃度高(gāo)導(dǎo)致(zhì)沉澱，或pH值(zhí)過低導(dǎo)致(zhì)蛋(dàn)白沉澱，也(yě)會(huì)影響(xiǎng)WB結果的準(zhǔn)確(què)性。

(2) 實驗操(cāo)作(zuò)的(dí)精(jīng)確性(xìng)

在進行(háng)qPCR時，如(rú)果引物(wù)設(shè)計策略有(yǒu)誤，引(yǐn)物形成二聚(jù)體，熔合曲綫呈(chéng)現雙峰，或引物(wù)實際擴增效率未(wèi)檢測而(ér)默認為(wéi)100%計算(suàn)，都可能(néng)導致結果不準(zhǔn)確(què)。

在WB實驗中(zhōng)，如果(guǒ)電泳，轉膜，抗(kàng)體(tǐ)孵(fū)育(yù)，發光成像等(děng)環節(jié)出現(xiàn)失(shī)誤，如電泳(yǒng)電壓不(bù)穩定(dìng)，轉(zhuǎn)膜(mó)不(bù)wanquan，抗(kàng)體(tǐ)濃(nóng)度不合(hé)適，曝光(guāng)時(shí)間不當(dāng)等(děng)，也(yě)會影響(xiǎng)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二，生物(wù)學(xué)層(céng)麵的(dí)原因(yīn)

(1) 翻(fān)譯後(hòu)調控(kòng)或修(xiū)飾

有時(shí)蛋白的mRNA水平可(kě)能(néng)保持不變，但(dàn)經過翻(fān)譯(yì)過(guò)程後蛋(dàn)白的產量(liáng)顯(xiǎn)著(zhù)增加(jiā)。因此，即使mRNA水(shuǐ)平沒有(yǒu)變化(huà)，也(yě)可能(néng)出現蛋(dàn)白水(shuǐ)平升(shēng)高的情(qíng)況(kuàng)。相(xiāng)反，如(rú)果存在(zài)一些(xiē)影(yǐng)響翻譯(yì)過(guò)程的(dí)因素，也可(kě)能(néng)導(dǎo)致mRNA水(shuǐ)平(píng)高(gāo)而(ér)蛋白水平低的(dí)情(qíng)況。

同時(shí)，蛋(dàn)白質在(zài)合(hé)成(chéng)後可能會(huì)經歷各種翻(fān)譯後調(tiáo)控(kòng)或修飾過(guò)程，如磷(lín)酸化，糖(táng)基化，泛(fàn)素(sù)化(huà)等。這些(xiē)修飾(shì)過程(chéng)可能影響蛋(dàn)白質(zhì)的穩定(dìng)性，活(huó)性(xìng)或(huò)定(dìng)位，從而(ér)導致(zhì)WB結果與qPCR結果不(bù)一致(zhì)。

(2) 延(yán)遲(chí)效應

蛋(dàn)白質合成需要耗費(fèi)時間(jiān)，而mRNA表(biǎo)達則能迅速(sù)響應外(wài)界刺激。因此，在某些情況下(xià)，mRNA的(dí)變動可能(néng)比(bǐ)蛋(dàn)白質(zhì)水(shuǐ)平(píng)的變化(huà)來(lái)得早或晚(wǎn)，導(dǎo)致(zhì)兩(liǎng)者之間(jiān)的結果不一致(zhì)的情況(kuàng)。

(3) mRNA剪接多變數

轉(zhuǎn)錄後(hòu)的mRNA可(kě)能產生多種(zhǒng)剪接體(tǐ)。而(ér)qPCR往往隻針對其中(zhōng)一段進行擴增(zēng)和(hé)檢測。因此(cǐ)，即(jí)使(shǐ)檢測到的mRNA水(shuǐ)平(píng)下降了，其(qí)他剪接體可(kě)能正在增加，導致(zhì)蛋(dàn)白質水平(píng)反而上(shàng)升，這種現(xiàn)象需要(yào)我(wǒ)們特別留意。

(4) 蛋(dàn)白(bái)翻譯後(hòu)的(dí)穩定性

蛋白在翻譯後(hòu)可(kě)能(néng)會(huì)經歷(lì)各種修飾(shì)，這(zhè)些修飾(shì)可能會(huì)影(yǐng)響蛋白的(dí)穩(wěn)定(dìng)性。舉(jǔ)例來說，增(zēng)加泛素(sù)化(huà)修飾(shì)可(kě)能(néng)會促進蛋白通過(guò)蛋白(bái)酶體(tǐ)途(tú)徑進行(háng)降(jiàng)解(jiě)，從(cóng)而導致(zhì)蛋白(bái)水(shuǐ)平(píng)下降。

(5) 負反(fǎn)饋機製(zhì)調節

細(xì)胞內(nèi)存在負(fù)反(fǎn)饋(kuì)機製來(lái)調節mRNA和蛋白質(zhì)的(dí)水平。有(yǒu)時蛋白的mRNA水(shuǐ)平(píng)可(kě)能保(bǎo)持不變(biàn)，但(dàn)經過翻譯(yì)過(guò)程(chéng)後蛋白的產(chǎn)量(liáng)顯著(zhù)增(zēng)加。因此，即使(shǐ)mRNA水平沒有(yǒu)變化(huà)，也可能(néng)出現蛋白水(shuǐ)平升高的情況。相反，如果存(cún)在一些(xiē)影(yǐng)響翻譯(yì)過程(chéng)的(dí)因(yīn)素，也(yě)可能導致(zhì)mRNA水平(píng)高而蛋白(bái)水(shuǐ)平低(dī)的(dí)情況。這種動(dòng)態平(píng)衡機(jī)製可能導(dǎo)致(zhì)mRNA和蛋白質(zhì)水平在不(bù)同(tóng)時間點出現(xiàn)不一(yī)致。

三(sān)，數據處理與(yǔ)分(fēn)析(xī)層(céng)麵的原(yuán)因(yīn)

(1) 定(dìng)量(liáng)方法(fǎ)的差異

qPCR和(hé)WB分別采(cǎi)用不同(tóng)的(dí)定(dìng)量方法。qPCR通(tōng)過(guò)檢測熒光(guāng)信號的(dí)變(biàn)化來實(shí)時定(dìng)量(liáng)PCR擴(kuò)增產物(wù)量的(dí)變化(huà)；而WB則通(tōng)過抗體(tǐ)與蛋白(bái)質(zhì)的結合(hé)來檢測蛋白(bái)質(zhì)的(dí)表達水(shuǐ)平。這兩(liǎng)種方法(fǎ)可(kě)能在(zài)定(dìng)量範圍和靈敏度(dù)上(shàng)存在(zài)差(chà)異，導(dǎo)致(zhì)結果(guǒ)不(bù)一(yī)致(zhì)。

(2) 結果解讀的主觀性

在(zài)進(jìn)行WB結果(guǒ)分(fēn)析時(shí)，通(tōng)常需要根據蛋白質條(tiáo)帶的(dí)顏色和深(shēn)淺(qiǎn)來(lái)判斷(duàn)蛋白(bái)質(zhì)的(dí)表(biǎo)達水平(píng)。這種判斷過程(chéng)存在(zài)一定的(dí)主(zhǔ)觀(guān)-性(xìng)，可能(néng)導(dǎo)致(zhì)不同(tóng)研究者對同一結(jié)果產(chǎn)生(shēng)不同的(dí)解讀。

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