酶聯免疫吸(xī)附(fù)試(shì)驗(yàn)(ELISA)是(shì)一(yī)種常用的(dí)基於(yú)抗原和抗體(tǐ)之(zhī)間(jiān)特異性(xìng)鍵(jiàn)的分析(xī)免疫(yì)化學測定
。ELISA實驗優(yōu)化(huà)過程中應測試許多(duō)因素，例如(rú)用於(yú)包衣的抗原或抗體(tǐ)的(dí)濃(nóng)度(dù)，溫度，各(gè)個(gè)步(bù)驟的(dí)持續時間，包(bāo)被緩衝液(yè)的類(lèi)型，例(lì)如磷(lín)酸(suān)鹽緩衝鹽水(shuǐ)(PBS)或(huò)碳酸鹽緩(huǎn)衝液，樣(yàng)品(pǐn)製備方(fāng)法
。那(nà)麼(mó)我們該(gāi)如何(hé)優化ELISA實驗(yàn)呢？讓我(wǒ)們一(yī)起(qǐ)來看看吧！
 

　　1. 抗原塗層
 

　　① ELISA的(dí)第一步是用抗(kàng)原(yuán)包(bāo)被(bèi)孔(kǒng)或捕獲抗體
。
 

　　② 大多(duō)數情(qíng)況(kuàng)下，這包(bāo)括將(jiāng)PBS或(huò)碳酸(suān)鹽(yán)緩衝(chōng)液中的蛋(dàn)白質(zhì)溶液(yè)應用於(yú)微(wēi)量滴板(bǎn)孔(kǒng)
。用於(yú)包(bāo)被蛋(dàn)白(bái)質的微量滴定板是(shì)具(jù)有改(gǎi)性(xìng)表麵(miàn)的特殊(shū)板(bǎn)，即對(duì)具有(yǒu)極性或親(qīn)水基團(tuán)的(dí)分子具有高親和(hé)力的(dí)高電荷聚(jù)苯(běn)乙烯(xī)表麵
。
 

　　2. 飽和(hé)阻斷
 

　　① 用(yòng)抗原(yuán)塗覆(fù)ELISA板(bǎn)的過(guò)程(chéng)依賴(lài)於孔(kǒng)固(gù)相的(dí)結合活(huó)性，該(gāi)固(gù)相(xiāng)將(jiāng)生物分子固定在(zài)孔(kǒng)表(biǎo)麵
。之(zhī)後的(dí)步(bù)驟是阻(zǔ)塞(sāi)
。在(zài)封閉(bì)過程中(zhōng)，孔底部的遊(yóu)離結(jié)合位點被(bèi)封閉(bì)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)飽(bǎo)和，以防止非特異性(xìng)結(jié)合(hé)的可能(néng)性(xìng)和(hé)孔(kǒng)的殘餘結合(hé)能(néng)力(lì)，從而大大(dà)提(tí)高信噪比和特(tè)異(yì)性
。如果不進(jìn)行適當的(dí)封(fēng)閉，檢(jiǎn)測抗(kàng)體(tǐ)可(kě)能(néng)會與抗(kàng)原(yuán)非特(tè)異(yì)性結(jié)合，導致高背景(jǐng)信號(hào)和(hé)低(dī)靈(líng)敏(mǐn)度(dù)
。
 

　　② 每(měi)個封(fēng)閉緩(huǎn)衝區都代表了減少(shǎo)背景和(hé)保持(chí)特(tè)異性(xìng)之間(jiān)的折(zhē)衷(zhōng)方案(àn)
。在某些(xiē)情況(kuàng)下(xià)，全血清和(hé)血清蛋(dàn)白(bái)白(bái)蛋白可引起非特(tè)異性ELISA信號
。
 

　　3. 樣(yàng)品製(zhì)備
 

　　稀(xī)釋(shì)劑的(dí)選(xuǎn)擇很重要
。通(tōng)常，標準(zhǔn)稀(xī)釋劑(jì)應(yīng)盡(jìn)可(kě)能與(yǔ)樣品(pǐn)的基(jī)質相似
。
 

　　① 例(lì)如，含BSA的(dí)PBS是(shì)ELISA中良(liáng)好(hǎo)的血清替代品，常用於(yú)生物學樣品(pǐn)
。下(xià)一個(gè)重要的稀釋劑成分(fēn)是非離子(zǐ)去(qù)汙劑(jì)(吐溫20，TritonX-100，CHAPS)，在低濃(nóng)度(dù)下(xià)，可(kě)防(fáng)止非(fēi)特異性(疏水(shuǐ)性)蛋白質-蛋白(bái)質(zhì)相(xiāng)互作用(yòng)
。特異性結合通(tōng)常對(duì)洗滌劑更具抵抗力
。
 

　　② 如(rú)果分析物(wù)不(bù)是血清(qīng)，則可(kě)能(néng)需(xū)要(yào)選擇與PBS/Tween/BSA不同(tóng)的(dí)稀(xī)釋(shì)劑
。在這種情況下，有(yǒu)必要檢查實(shí)驗樣品的標準(zhǔn)曲綫和稀釋(shì)綫性(xìng)
。其原(yuán)因是(shì)標準(zhǔn)稀釋劑或matix的成分(fēn)對(duì)抗原(yuán)/抗(kàng)體(tǐ)相互作(zuò)用的影(yǐng)響
。在(zài)這種(zhǒng)情況(kuàng)下(xià)，應(yīng)進(jìn)行加(jiā)標(biāo)回(huí)收或(huò)綫性(xìng)稀(xī)釋實驗
。
 

　　③ 加標回(huí)收：將(jiāng)一定量的(dí)標準(zhǔn)品加(jiā)入(加(jiā)標)到樣品緩(huǎn)衝液(yè)或(huò)樣(yàng)品(pǐn)中，並(bìng)與(yǔ)未添加標(biāo)準(zhǔn)品的(dí)樣品同(tóng)時測(cè)量
。可以比(bǐ)較(jiào)添加(jiā)到天(tiān)然測試樣(yàng)品基質(zhì)中的(dí)相(xiāng)同量(liáng)的(dí)分(fēn)析物和(hé)添加(jiā)到(dào)標(biāo)準(zhǔn)稀(xī)釋(shì)劑中(zhōng)的(dí)相(xiāng)同加標(biāo)值
。
 

　　④ 在測試(shì)實驗(yàn)樣品(pǐn)時，重要(yào)的是測試幾種稀釋液，全部(bù)一式兩(liǎng)份(fèn)或(huò)一式(shì)三(sān)份(fèn)，並結(jié)合已知標準品進行，以(yǐ)確(què)保(bǎo)最終結(jié)果(guǒ)落(là)在(zài)標準曲(qū)綫的綫(xiàn)性部分(fēn)內(nèi)
。
 

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