讓(ràng)小編(biān)來(lái)詳細(xì)解析(xī)一(yī)下(xià)qPCR（實時熒光(guāng)定量(liáng)PCR）的(dí)原理(lǐ)
。這是一(yī)項在分(fēn)子(zǐ)生物(wù)學，醫學診(zhěn)斷，生物(wù)技(jì)術(shù)等(děng)領域的核心技術
。

 一，qPCR的核(hé)心原理(lǐ)：實(shí)時(shí)監(jiān)測與(yǔ)定量

簡單來說(shuō)
，qPCR是(shì)一(yī)種(zhǒng)在(zài)PCR（聚(jù)合酶鏈(liàn)式反應）擴增過(guò)程(chéng)中
，通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)DNA模板進行(háng)實時(shí)監(jiān)測和定(dìng)量(liáng)的技(jì)術(shù)
。

它(tā)解決(jué)了(liǎo)傳統PCR隻(zhī)能(néng)進(jìn)行終點檢測(cè)（擴增(zēng)結(jié)束(shù)後通過(guò)電泳(yǒng)看(kàn)條帶）而無法精(jīng)確定(dìng)量(liáng)的問(wèn)題(tí)
。

二(èr)，兩種主流的信(xìn)號產生機製：

 1. 非特異性(xìng)檢測：DNA結(jié)合(hé)染料法（如(rú)SYBR Green）

- 原理(lǐ)：SYBR Green是一種能(néng)特(tè)異性(xìng)地嵌入雙鏈(liàn)DNA（dsDNA）小(xiǎo)溝中的(dí)熒光染料
。當它與dsDNA結合後
，熒光強度會(huì)顯著(zhù)增(zēng)強
。

- 過(guò)程：在每(měi)輪PCR的延(yán)伸階(jiē)段
，新(xīn)合成的雙(shuāng)鏈(liàn)DNA會結(jié)合染(rǎn)料(liào)
，並發(fā)出熒光
。熒(yíng)光強(qiáng)度與(yǔ)反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)中的雙(shuāng)鏈(liàn)DNA總(zǒng)量(liáng)成(chéng)正(zhèng)比
。

- 優(yōu)點(diǎn)：成(chéng)本(běn)低(dī)
，使用(yòng)方便
，無需設計(jì)探針
，適用於任何PCR擴增
。

- 缺(quē)點：特異性較(jiào)低
。染(rǎn)料(liào)會結(jié)合(hé)任何雙鏈(liàn)DNA
，包(bāo)括非(fēi)特異性(xìng)擴增產物(wù)和引物二(èr)聚(jù)體
，從(cóng)而產生假(jiǎ)陽性信號(hào)
。因此必須(xū)通(tōng)過熔解曲(qū)綫分(fēn)析(xī)來(lái)驗證擴(kuò)增(zēng)產物(wù)的特(tè)異性(xìng)
。

 2. 特(tè)異(yì)性檢測：水(shuǐ)解(jiě)探(tàn)針(zhēn)法（如(rú)TaqMan探針）

- 原理：該技術使用一個序列(liè)特異(yì)性的寡核(hé)苷酸探(tàn)針
。探針的5‘端帶(dài)有(yǒu)一個(gè)報(bào)告熒光基團
，3’端帶(dài)有一(yī)個淬滅熒(yíng)光基團
。

- 過程：

    1.  當探針完(wán)整時
，由於報(bào)告(gào)基(jī)團和(hé)淬滅基(jī)團距離很近
，發(fā)生熒光共(gòng)振(zhèn)能(néng)量(liáng)轉移
，報告(gào)基團(tuán)的熒(yíng)光被淬滅(miè)
。

    2.  PCR擴增時(shí)
，當(dāng)引(yǐn)物(wù)退火(huǒ)
，探(tàn)針(zhēn)也會(huì)特(tè)異性地(dì)結合到模(mó)板上
。

    3.  Taq酶(méi)在延伸(shēn)過(guò)程中
，利用其5‘→3’外切(qiē)核酸酶(méi)活性(xìng)將探針(zhēn)水(shuǐ)解(jiě)
，使報告基(jī)團與淬(cuì)滅基(jī)團分離(lí)
。

    4.  報告基團(tuán)隨即發出熒(yíng)光(guāng)
。

- 優(yōu)點：特(tè)異(yì)性ji高
。隻有(yǒu)靶(bǎ)序(xù)列(liè)被(bèi)擴增時才會(huì)產(chǎn)生熒(yíng)光信號
，有(yǒu)效(xiào)避(bì)免(miǎn)了非特異(yì)性(xìng)擴(kuò)增的幹(gān)擾(rǎo)
。

- 缺(quē)點：成(chéng)本(běn)較高
，需要(yào)為每(měi)個靶(bǎ)基因(yīn)精心(xīn)設計(jì)並合(hé)成(chéng)探針(zhēn)
。

 三(sān)，如何定(dìng)量(liáng)？—— Ct值(zhí)的(dí)概念

qPCR定(dìng)量的(dí)關鍵在(zài)於(yú) Ct值(zhí)
。

- 定(dìng)義：Ct值(zhí) 是指(zhǐ)每個(gè)反應(yīng)管(guǎn)內的熒(yíng)光(guāng)信(xìn)號達(dá)到設定(dìng)的(dí)閾值時所(suǒ)經歷(lì)的循環(huán)數
。

- 意義：模板DNA的(dí)起始拷(kǎo)貝(bèi)數越多
，達到(dào)熒光(guāng)閾(yù)值(zhí)所需的擴(kuò)增循環數就越(yuè)少(shǎo)
，即Ct值越小(xiǎo)
。反(fǎn)之(zhī)
，起始(shǐ)拷(kǎo)貝數越少(shǎo)
，Ct值越(yuè)大
。

- 定(dìng)量基礎：理論(lùn)上(shàng)
，PCR每個循環產物(wù)量翻(fān)倍(bèi)（指數(shù)增長期）
。因此(cǐ)
，兩(liǎng)個樣品(pǐn)之間的Ct值(zhí)相(xiāng)差1
，意味著起(qǐ)始模(mó)板(bǎn)量(liáng)相差(chà)約2倍
。

通(tōng)過已知濃(nóng)度的(dí)標(biāo)準品繪製標準曲綫
，就可以(yǐ)根(gēn)據未(wèi)知樣品的(dí)Ct值精(jīng)確計(jì)算出其起(qǐ)始(shǐ)模(mó)板量
。定量方(fāng)法主(zhǔ)要有絕對定量和相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)
。

  總結

qPCR技術(shù)憑(píng)借其(qí)高靈敏(mǐn)度(dù)，高特異性(xìng)，精確(què)定量和操作(zuò)便捷的特點(diǎn)
，已經(jīng)成(chéng)為現代生命科學研究(jiū)和分子診(zhěn)斷的基(jī)石(shí)技(jì)術
。從(cóng)基(jī)礎科研(yán)的(dí)基因功能探(tàn)索
，到臨床的(dí)疾病(bìng)診斷(duàn)與監控(kòng)
，再(zài)到(dào)食(shí)品(pǐn)安(ān)全檢測
，其應用無處(chǔ)不在
。理解其(qí)原理是正(zhèng)確進行(háng)實驗(yàn)設計和數據分(fēn)析的關(guān)鍵
。

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。

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1.國(guó)內試劑(jì)耗材經銷代理(lǐ)
；

2.國(guó)外試劑(jì)訂購（直(zhí)訂
，或(huò)境(jìng)外(wài)代理）
；

3.基因組測序(xù)（二(èr)代
，二代+三(sān)代(dài)）
；

4.基因分型（SNP檢(jiǎn)測）：低/中/中(zhōng) 高(gāo)通量項目
；

5.生物樣本運輸（國內(nèi)，）
；

二(èr)，多家代(dài)理品牌
，涉(shè)及30多(duō)種
，經(jīng)營代(dài)理500多(duō)個(gè)品牌：

Qiagen，Sigma，R&D，Epigentek，ThermoFisher，DNA Genotek，USA Scientific，

Matreya，Sage Science，List Labs，Macrocyclics，Steraloids，

NIBSC，mobio，immunodx，cellsystems，medicago，abcam

CST，Roche，Bethyl，sino Biological，clodrosome，adi

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International Humic，biocytex，Toxin Technology  ，Streck

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ZYMO，Cygnus Technologies LLC，Enzyme Research，Bio/Data Corporation

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horizondiscovery，Reagents，megazyme，elisasystems………

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。大部(bù)分(fēn)客(kè)戶我(wǒ)們(mén)提供(gōng)貨(huò)到(dào)付款(kuǎn)服(fú)務
，