這款試劑盒是一(yī)款性(xìng)能(néng)優(yōu)異(yì)，操作非常簡便的(dí)預混式(shì)反(fǎn)轉錄(lù)試劑，它將所(suǒ)有(yǒu)所需(xū)組(zǔ)分（除(chú)模板(bǎn)RNA和RNase Free水(shuǐ)外）預先混(hùn)合在(zài)一起，大大減(jiǎn)少(shǎo)了(liǎo)操作步(bù)驟(zhòu)和汙(wū)染(rǎn)風(fēng)險。

Takara RR047A 操(cāo)作(zuò)步驟
：

以下(xià)是標準(zhǔn)的操(cāo)作流程(chéng)，非常(cháng)簡潔(jié)。在進(jìn)行操作(zuò)前(qián)，請務必(bì)在冰上(shàng)進行(háng)，並使用RNase-Free的槍頭和試管。

 實驗前準備
：

1.  RNA模板
： 確保(bǎo)RNA質量(liáng)好，無降(jiàng)解，無基(jī)因組(zǔ)DNA汙(wū)染。建(jiàn)議(yì)使(shǐ)用前用DNase I處理RNA樣(yàng)本(běn)。

2.  試(shì)劑解凍
： 將RR047A Master Mix置於冰(bīng)上wanquan解(jiě)凍，使(shǐ)用前輕輕(qīng)渦旋(xuán)混匀(yún)，避免(miǎn)產(chǎn)生(shēng)氣泡。

 第(dì)一步
：配製反應體係

在(zài)一個無菌，無(wú)RNase的(dí)微量離心管(guǎn)中(zhōng)，按以(yǐ)下(xià)順序(xù)和用(yòng)量(liáng)加(jiā)入各組(zǔ)分
：

總(zǒng)體積
： 20 µL

計(jì)算(suàn)示(shì)例(lì)
： 如果(guǒ)你(nǐ)要加入 500 ng 的 RNA（濃度為(wéi) 100 ng/µL，則(zé)需要(yào) 5 µL），那麼計算(suàn)如下(xià)
：

   5× Master Mix
： 4 µL

   RNA
： 5 µL

   RNase Free dH₂O
： 20 - 4 - 5 = 11 µL

注(zhù)意
： 輕(qīng)輕用移(yí)液(yè)器吹打(dǎ)混匀，短(duǎn)暫離心(xīn)收集(jí)液(yè)滴至管底。

 第(dì)二(èr)步
：進(jìn)行(háng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將配製好(hǎo)的反(fǎn)應管(guǎn)放(fàng)入PCR儀或(huò)水浴鍋中(zhōng)，按以(yǐ)下程序(xù)運(yùn)行
：

1.  37°C for 15 分鐘 （反(fǎn)轉錄(lù)反應）

2.  85°C for 5 秒(miǎo) （反轉(zhuǎn)錄酶失活(huó)反應(yīng)）

3.  4°C 保持 （暫時(shí)保存(cún)）

程序解(jiě)讀
：

   37°C， 15分鐘(zhōng)
： 這是反轉錄酶(méi)合(hé)成(chéng)cDNA的最佳溫度和時間。

   85°C， 5秒(miǎo)
： 這是(shì)一(yī)個(gè)快速的(dí)熱(rè)失活(huó)步(bù)驟，用(yòng)於(yú)滅活(huó)反轉錄酶，防止(zhǐ)其(qí)在後續(xù)的qPCR反(fǎn)應(yīng)中幹擾(rǎo)Taq酶的(dí)活(huó)性。這是RR047A的一個重(zhòng)要(yào)優點(diǎn)，無需(xū)復(fù)雜的純(chún)化(huà)步驟(zhòu)即可(kě)直(zhí)接用(yòng)於qPCR。

 第三步(bù)
：產物(wù)保(bǎo)存(cún)與使(shǐ)用

   反應(yīng)結束(shù)後，將得(dé)到的(dí)cDNA溶液置(zhì)於(yú)冰上，可立(lì)即用於(yú)後續的(dí)PCR或qPCR實驗。

   若需(xū)長期(qī)保存，請置於(yú) -20°C 冰(bīng)箱。避免反(fǎn)復(fù)凍融，建議(yì)分(fēn)裝(zhuāng)保存。

 注(zhù)意事(shì)項
：

1.  RNA質量(liáng)
： 這(zhè)是(shì)實驗成功的首要(yào)條件(jiàn)。確保(bǎo)RNA的完整性（通過(guò)瓊脂糖(táng)凝膠電(diàn)泳(yǒng)檢查(chá)），並且A260/A280比(bǐ)值在1.8-2.0之間，表明純(chún)度良好。

2.  無基(jī)因組DNA汙(wū)染
： 如(rú)果(guǒ)後續進行qPCR並(bìng)需(xū)要高精度定量(liáng)，強烈(liè)建議在反轉(zhuǎn)錄前(qián)用gDNA Eraser（Takara的另(lìng)一款(kuǎn)產(chǎn)品）處理(lǐ)RNA樣(yàng)本，以ce di去除(chú)基因(yīn)組(zǔ)DNA。

3.  無RNase操(cāo)作
： 全(quán)程使用(yòng)RNase-free的槍(qiāng)頭，離(lí)心管(guǎn)和試(shì)劑，佩戴(dài)手套，防止RNase汙(wū)染導致RNA降解(jiě)。

4.  精(jīng)確(què)加(jiā)樣
： 確(què)保所(suǒ)有(yǒu)組分的加(jiā)樣(yàng)量(liáng)準確，尤其是(shì)Master Mix和(hé)RNA模(mó)板(bǎn)。

5.  陰性對照
： 建(jiàn)議設(shè)置一(yī)個無酶對照(zhào)（No-RT Control），即用等(děng)量的水(shuǐ)代(dài)替Master Mix。這個對(duì)照在(zài)後續qPCR中用(yòng)於檢(jiǎn)測是(shì)否(fǒu)有基(jī)因組DNA的殘留(liú)擴(kuò)增。

 總(zǒng)結

Takara RR047A（PrimeScript RT Master Mix） 的(dí)核(hé)心(xīn)優(yōu)勢在於(yú)其(qí)預(yù)混(hùn)形(xíng)式和快速熱(rè)失活特性(xìng)。它將(jiāng)復雜的多組分混合(hé)步(bù)驟簡(jiǎn)化為“一(yī)步加(jiā)樣"，並(bìng)通(tōng)過短短5秒(miǎo)的(dí)85°C加熱即可滅(miè)活酶(méi)活(huó)，使得從(cóng)RNA到cDNA再到qPCR的整(zhěng)個過程可(kě)以無縫(féng)，高效，高(gāo)通量地進行，極大地(dì)提高了實(shí)驗的重(zhòng)復性(xìng)和便(biàn)捷性，特別適用於基(jī)因(yīn)表達(dá)分析(xī)（qRT-PCR）研(yán)究。

——天(tiān)津(jīn)益元(yuán)利康生物科(kē)技(jì)有限(xiàn)公司

是(shì)一家(jiā)專注(zhù)於生命科(kē)學實驗(yàn)室快速消(xiāo)耗(hào)品(pǐn)為主(zhǔ)營方向(xiàng)的生(shēng)命(mìng)科(kē)技企(qǐ)業(yè)，提(tí)供完(wán)整的產(chǎn)品和(hé)服務體係，為(wéi)廣(guǎng)大的(dí)科(kē)研用戶提供(gōng)實(shí)驗室一(yī)站式(shì)服務。益(yì)元(yuán)利(lì)康(kāng)已(yǐ)成為多(duō)家生物(wù)品牌的代理(lǐ)商，如(rú)ALZET，MedKoo，EZB，WaKo，Zymoresearch，Qiagen等(děng)，為用戶(hù)提供*的產品，專業的(dí)咨詢(xún)，助(zhù)力(lì)推(tuī)動中(zhōng)國生命科(kē)學研(yán)究快(kuài)速發展(zhǎn)。