聚乙烯亞胺（Polyethylenimine, PEI）作為一(yī)種(zhǒng)陽離子聚(jù)合物(wù)轉(zhuǎn)染試劑，因其(qí)高(gāo)效的(dí)基因(yīn)遞送能力和(hé)較低(dī)的細胞毒性(xìng)，已(yǐ)成(chéng)為哺(bǔ)乳動物(wù)細胞(bāo)瞬時轉染和病毒載(zǎi)體生(shēng)產(chǎn)的(dí)工(gōng)具之一。本文(wén)係(xì)統(tǒng)介紹(shào)了使(shǐ)用(yòng)Polysciences公(gōng)司(sī)PEI Max轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行HEK293T細(xì)胞轉染(rǎn)的(dí)標準實驗流程(chéng)，為基因功能研究(jiū)和重(zhòng)組蛋白表達提(tí)供可靠的技術參考。

一(yī)，實驗原(yuán)理(lǐ)

PEI是一種(zhǒng)帶正電荷(hé)的高分子(zǐ)聚合(hé)物，其分子結構(gòu)中富含氨(ān)基基團(tuán)，在(zài)生(shēng)理pH條件下可(kě)質(zhì)子(zǐ)化(huà)形(xíng)成(chéng)正(zhèng)電(diàn)荷(hé)密度(dù)。這種(zhǒng)特性(xìng)使(shǐ)PEI能夠(gòu)通(tōng)過靜(jìng)電相互(hù)作(zuò)用(yòng)與帶(dài)負電荷(hé)的質(zhì)粒(lì)DNA形成(chéng)納米級復合物（polyplex），有效壓縮DNA並(bìng)保(bǎo)護(hù)其免受核(hé)酸酶降解。PEI-DNA復(fù)合(hé)物通(tōng)過(guò)內(nèi)吞(tūn)作用進(jìn)入細胞(bāo)，隨後(hòu)PEI的(dí)"質子(zǐ)海綿(mián)效(xiào)應(yīng)"促進內(nèi)涵體逃逸(yì)，使(shǐ)DNA釋放(fàng)至(zhì)細胞核(hé)內完(wán)成轉(zhuǎn)錄表達。

二(èr)，材料(liào)與(yǔ)試(shì)劑

主(zhǔ)要(yào)試劑(jì)：

PEI Max®—Transfection Grade Linear Polyethyleneimine Hydrochloride（MW 40,000，Polysciences，貨(huò)號(hào)24765或23966）

HEK293T細(xì)胞（ATCC CRL-3216）

高(gāo)純度(dù)質(zhì)粒DNA（無內(nèi)毒(dú)素(sù)，A260/A280比(bǐ)值(zhí)1.8-2.0）

Opti-MEM減血清培(péi)養基（Gibco）

wanquanDMEM培養(yǎng)基（含(hán)10% FBS，1×GlutaMAX，青黴(méi)素-鏈黴素）

儀器設備：

生(shēng)物安全櫃，CO₂培養箱(xiāng)（37°C，5% CO₂），台(tái)式(shì)離心(xīn)機，倒(dǎo)置熒(yíng)光(guāng)顯微鏡

三，實驗方法

3.1 細胞準備(bèi)

轉(zhuǎn)染前(qián)24小時(shí)，將(jiāng)HEK293T細胞(bāo)以(yǐ)3×10⁶個(gè)細胞/10 cm培養皿(mǐn)的(dí)密(mì)度接種(zhǒng)於(yú)wanquanDMEM培養(yǎng)基中，確保轉染時(shí)細胞匯合(hé)度達到70-90%。細(xì)胞狀(zhuàng)態直(zhí)接影響(xiǎng)轉染效率，應(yīng)選(xuǎn)用處於對數生長期，形態(tài)良(liáng)好(hǎo)，無支(zhī)原體(tǐ)汙(wū)染(rǎn)的(dí)細(xì)胞。

3.2 PEI工作(zuò)液配製(zhì)

將PEI Max粉(fěn)末溶(róng)解(jiě)於(yú)Milli-Q水(shuǐ)中，配製(zhì)1 mg/mL儲(chǔ)存液，經0.22 μm濾膜過(guò)濾(lǜ)除(chú)菌(jūn)後分(fēn)裝保存(cún)於(yú)-20°C，避免(miǎn)反復凍(dòng)融。使(shǐ)用(yòng)前(qián)解(jiě)凍(dòng)並充分混匀(yún)。

3.3 轉染(rǎn)復(fù)合物製備

采用DNA:PEI質(zhì)量(liáng)比(bǐ)1:3的(dí)優化方(fāng)案：

在(zài)無(wú)菌EP管(guǎn)中，將(jiāng)10 μg質粒(lì)DNA稀釋於500 μL Opti-MEM中，輕柔混匀（Mix 1）

另(lìng)取一(yī)管(guǎn)，將30 μL PEI工(gōng)作(zuò)液(yè)（1 mg/mL）稀(xī)釋於(yú)500 μL Opti-MEM中，室溫靜置5分鐘(zhōng)（Mix 2）

將(jiāng)Mix 2逐滴加入(rù)Mix 1中，輕(qīng)輕渦旋混匀，室溫孵(fū)育15-20分鐘，形成DNA-PEI復合物

3.4 轉染(rǎn)操(cāo)作

吸除培養皿中(zhōng)的舊培養(yǎng)基，用預溫PBS輕柔洗(xǐ)滌(dí)細(xì)胞一次(cì)

加入(rù)8 mL新鮮wanquanDMEM培養(yǎng)基（含血(xiě)清和抗(kàng)生(shēng)素）

將轉(zhuǎn)染復合(hé)物逐滴(dī)均匀加(jiā)入培養(yǎng)皿(mǐn)中，輕(qīng)輕(qīng)晃動使混合均(jūn)匀

37°C，5% CO₂條件下繼續培(péi)養6小(xiǎo)時(shí)後(hòu)，可(kě)選擇更換為wanquan培(péi)養(yǎng)基（對於敏感(gǎn)細胞(bāo)係(xì)）

根據(jù)實驗(yàn)目的(dí)，在轉(zhuǎn)染(rǎn)後24-72小時收集細(xì)胞(bāo)進行後續分析(xī)

3.5 轉染效(xiào)率(shuài)評估(gū)

轉染後48小時，可通(tōng)過以下(xià)方法評估轉染效率：

熒光顯微鏡觀察：如(rú)使用GFP報(bào)告基(jī)因，直接在(zài)倒(dǎo)置熒(yíng)光(guāng)顯微(wēi)鏡下(xià)觀察並拍照(zhào)記錄(lù)

流式細胞術：胰(yí)酶(méi)消化(huà)細胞後，通(tōng)過流(liú)式細胞(bāo)儀定(dìng)量分析GFP陽(yáng)性細胞比例(lì)

Western Blot：檢(jiǎn)測(cè)目的蛋白(bái)表(biǎo)達(dá)水平(píng)，以β-actin作(zuò)為(wéi)內參

四(sì)，關(guān)鍵參(cān)數(shù)優化

4.1 DNA:PEI比(bǐ)例優化(huà)

不(bù)同細胞係對(duì)PEI的(dí)耐受(shòu)性(xìng)存(cún)在差異。對於HEK293T細胞，1:3的DNA:PEI質量(liáng)比(bǐ)通常可(kě)獲得zui-佳(jiā)轉(zhuǎn)染(rǎn)效(xiào)率（>80%）和(hé)細(xì)胞(bāo)活性的(dí)平(píng)衡。對(duì)於敏感細(xì)胞(bāo)係，可適當降低(dī)至(zhì)1:2或1:2.5。

4.2 細胞(bāo)密度(dù)控製

細(xì)胞匯合度(dù)過(guò)低(dī)（<60%）會(huì)導致轉染(rǎn)效(xiào)率(shuài)下(xià)降
；匯(huì)合度(dù)過高（>95%）則(zé)因接(jiē)觸(chù)抑製(zhì)影(yǐng)響細(xì)胞狀(zhuàng)態(tài)，建(jiàn)議(yì)維(wéi)持在(zài)70-90%。

4.3 血清存(cún)在(zài)下的(dí)轉染

PEI轉染可(kě)在血清存(cún)在條件(jiàn)下進行，這(zhè)簡化了(liǎo)操(cāo)作流(liú)程並(bìng)減(jiǎn)少了(liǎo)細胞應激。但(dàn)高(gāo)濃(nóng)度(dù)血清(qīng)（>10%）可能輕微降(jiàng)低(dī)轉染效率，建(jiàn)議(yì)在轉染(rǎn)復(fù)合(hé)物形(xíng)成(chéng)階段使用無血清(qīng)培(péi)養(yǎng)基。

五，慢病毒(dú)包(bāo)裝(zhuāng)應用(yòng)

PEI轉染試劑廣(guǎng)泛應(yīng)用於(yú)第(dì)三代慢病(bìng)毒包(bāo)裝係統：

將(jiāng)HEK293T細胞以1.8×10⁶/10 cm皿密(mì)度接(jiē)種，培(péi)養(yǎng)18小時

轉(zhuǎn)染(rǎn)混合物配(pèi)製（每皿）：

轉移(yí)質(zhì)粒（含(hán)目(mù)的基因）：10 μg

包裝質粒(lì)psPAX2：5 μg

包膜質粒(lì)pMD2.G：3-5 μg

PEI（1 mg/mL）：30-50 μL

轉(zhuǎn)染(rǎn)後(hòu)6-8小(xiǎo)時更換培養(yǎng)基，48小(xiǎo)時和(hé)72小(xiǎo)時(shí)分別(bié)收(shōu)集(jí)病(bìng)毒上清(qīng)

0.45 μm濾膜過(guò)濾(lǜ)，-80°C分裝保存(cún)或進行(háng)病毒濃縮

六，注(zhù)意事(shì)項

質粒質(zhì)量(liáng)：必(bì)須(xū)使(shǐ)用高純度，無(wú)內(nèi)毒素(sù)的(dí)質粒DNA，內毒素(sù)汙染(rǎn)會顯著降低(dī)轉(zhuǎn)染(rǎn)效率並誘導細胞死(sǐ)亡(wáng)

復(fù)合物形(xíng)成時間(jiān)：DNA-PEI孵育(yù)時(shí)間(jiān)應(yīng)控製在(zài)15-20分鐘，過(guò)長(cháng)會導致復合物聚集(jí)沉澱

細(xì)胞(bāo)傳(chuán)代次數(shù)：建(jiàn)議使用(yòng)低代(dài)次細(xì)胞(bāo)（<30代(dài)），高(gāo)代(dài)次(cì)細(xì)胞轉染效率可能下降

支(zhī)原(yuán)體檢(jiǎn)測：定期檢(jiǎn)測細(xì)胞支原體汙(wū)染，汙(wū)染細胞(bāo)轉染(rǎn)效率(shuài)顯著降低(dī)且(qiě)結果不可(kě)靠(kào)

七，結論(lùn)

Polysciences PEI Max轉(zhuǎn)染試(shì)劑憑借其高效(xiào)，經濟(jì)，操(cāo)作簡(jiǎn)便(biàn)的優勢(shì)，已成(chéng)為實(shí)驗室(shì)基因(yīn)遞(dì)送和病毒(dú)載體生(shēng)產的標準化工(gōng)具。通過優化轉染參數，研究(jiū)人(rén)員可在HEK293T等(děng)常用(yòng)細胞係(xì)中實(shí)現高(gāo)效(xiào)的基因表(biǎo)達(dá)和蛋白生產。

保障提示： 為確保實驗結果的可靠(kào)性和可(kě)重(zhòng)復(fù)性，建議(yì)通過(guò)正(zhèng)規(guī)渠道(dào)采(cǎi)購Polysciences轉染(rǎn)試劑。

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