在(zài)分子生物(wù)學(xué)研(yán)究中(zhōng)，實時(shí)熒(yíng)光(guāng)定量 PCR (qPCR) 是檢(jiǎn)測基因(yīn)表(biǎo)達水平的(dí)金標準。然(rán)而，RNA 樣(yàng)本(běn)中(zhōng)微(wēi)量(liáng)的基因組(zǔ) DNA (gDNA) 汙(wū)染(rǎn)往(wǎng)往(wǎng)會幹擾(rǎo)定量結(jié)果(guǒ)，導致假(jiǎ)陽性。Takara 推(tuī)出的 Takara RR036A (PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser) 正是(shì)為(wéi)解決這(zhè)一痛點而(ér)生。為(wéi)了(liǎo)確保實(shí)驗(yàn)的(dí)順(shùn)利進(jìn)行(háng)，深入研(yán)讀 Takara RR036A 說(shuō)明(míng)書，掌握其組(zǔ)分特性與(yǔ)操(cāo)作細節，是(shì)每一位(wèi)實(shí)驗(yàn)人(rén)員獲得高(gāo)保(bǎo)真(zhēn) cDNA 的前提(tí)。本文將基於說(shuō)明(míng)書內(nèi)容，詳細(xì)解(jiě)析該(gāi)試劑盒的(dí)核(hé)心優(yōu)勢(shì)，操作(zuò)流程(chéng)及(jí)注意事項(xiàng)。

——天津益(yì)元利康生物(wù)科(kē)技有(yǒu)限(xiàn)公(gōng)司(sī)

一(yī)， 產品概(gài)述與核心優勢(shì)

Takara RR036A 說明(míng)書(shū) 指出，該試(shì)劑盒全稱為 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)。它(tā)是(shì)一款(kuǎn)專(zhuān)門用於(yú)兩步(bù)法 Real Time PCR 的逆轉(zhuǎn)錄(lù) (RT) 試劑盒。其(qí)最大的亮(liàng)點(diǎn)在於配備了強效的(dí) gDNA Eraser (基(jī)因組(zǔ) DNA 去除(chú)酶)，能(néng)夠(gòu)在(zài)逆(nì)轉錄反應前高效去除(chú) RNA 模(mó)板(bǎn)中混有(yǒu)的(dí)基因(yīn)組 DNA。

1. 高效的(dí) gDNA 去(qù)除能力
   ：

   試(shì)劑(jì)盒中的(dí) gDNA Erase 是(shì)一種(zhǒng)具有ji高活(huó)性的(dí)酶混合(hé)物，能(néng)在 37°C 下迅速(sù)降解(jiě)雙鏈(liàn) DNA。根據 Takara RR036A 說明書 的驗(yàn)證(zhèng)數(shù)據，該處(chǔ)理(lǐ)步(bù)驟幾(jī)乎(hū)可以wan全(quán)消除 gDNA 對(duì)後續 qPCR 的幹擾(rǎo)，特(tè)別(bié)適(shì)用(yòng)於無(wú)內含(hán)子(zǐ)基因的檢(jiǎn)測。

2. 優異的(dí)逆轉錄性(xìng)能(néng)
   ：

   采用 Takara du有(yǒu)的 PrimeScript Reverse Transcriptase，這(zhè)是一種(zhǒng)具(jù)有(yǒu)強鏈置換(huàn)活性的 RNA 依賴性 DNA 聚合酶(méi)。它(tā)不(bù)僅對 RNA 二級(jí)結(jié)構具有(yǒu)ji強的耐受(shòu)性(xìng)，還能(néng)在(zài)高(gāo)溫下進行反(fǎn)應(yīng)，有(yǒu)效降低了(liǎo) RNA 二級結構(gòu)對(duì)逆轉錄的阻礙(ài)。

3. 廣(guǎng)泛的(dí)模板(bǎn)適用(yòng)性
   ：

   無論(lùn)是 Total RNA 還是 mRNA，無(wú)論(lùn)是高(gāo)豐度還(huán)是低(dī)豐(fēng)度(dù)基(jī)因，該(gāi)試(shì)劑盒均(jūn)能(néng)實(shí)現高(gāo)靈敏(mǐn)度，高重復性的(dí) cDNA 合(hé)成。

二(èr)， 試劑盒(hé)組(zǔ)分解(jiě)析(xī)

• 5x PrimeScript Buffer 2 (Real Time)
  ：含有(yǒu) dNTP Mixture 和 Mg2+ 的優(yōu)化緩衝(chōng)液，為逆(nì)轉(zhuǎn)錄(lù)酶提供最佳反應(yīng)環境。

• PrimeScript RT Enzyme Mix I
  ：含有 PrimeScript Reverse Transcriptase 和 RNase Inhibitor。RNase Inhibitor 的(dí)加(jiā)入(rù)有效防止了反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)內 RNase 對 RNA 模(mó)板的降解(jiě)。

• gDNA Eraser Buffer
  ：專為 gDNA Erase 設計的(dí)反應(yīng)緩(huǎn)衝液。

• gDNA Eraser
  ：用(yòng)於去除基因(yīn)組 DNA 的酶製(zhì)劑(jì)。

• Oligo dT Primer 和(hé) Random 6 mers
  ：提(tí)供兩種引物策略(lüè)。Oligo dT Primer 適用(yòng)於具(jù)有 Poly (A) 尾(wěi)巴(bā)的 mRNA；Random 6 mers 則適(shì)用(yòng)於(yú) rRNA，不具 Poly (A) 尾的 RNA 或長片段 RNA 的逆轉錄。Takara RR036A 說(shuō)明(míng)書 建(jiàn)議(yì)根據(jù)實驗需(xū)求選(xuǎn)擇或混(hùn)合(hé)使(shǐ)用。

三， 標準(zhǔn)操作(zuò)流程(chéng)詳解

1. 第一步(bù)
   ：基(jī)因(yīn)組(zǔ) DNA 去除(chú)反(fǎn)應(yīng)

• 體係配製(zhì)
  ：在冰(bīng)上(shàng)配製(zhì)反應液(yè)，包含 5x gDNA Eraser Buffer，gDNA Eraser，Total RNA 和(hé) RNase Free dH2O。

• 反(fǎn)應條件
  ：42°C 孵育(yù) 2 分(fēn)鐘（或根據說(shuō)明書建(jiàn)議(yì)時間(jiān)），隨(suí)後(hòu) 4°C 保(bǎo)存。此步驟極為關鍵，務(wù)必(bì)嚴(yán)格控製時(shí)間，避免過(guò)度處理。

• 終止
  ：該步驟完(wán)成後(hòu)，體(tǐ)係(xì)直接用(yòng)於下一(yī)步，無需純化。

2. 第二步
   ：逆(nì)轉(zhuǎn)錄反(fǎn)應(yīng)

• 體係配(pèi)製(zhì)
  ：向(xiàng)第一步的(dí)反應(yīng)液中(zhōng)直(zhí)接加入 5x PrimeScript Buffer 2，PrimeScript RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer/Random 6 mers 和 RNase Free dH2O。

• 反(fǎn)應條件
  ：通常程序為(wéi) 37°C 逆轉錄(lù) 15 分(fēn)鐘，隨(suí)後(hòu) 85°C 加熱 5 秒鐘使酶(méi)失(shī)活，最(zuì)後 4°C 保(bǎo)存。

• 結果
  ：反應結(jié)束後(hòu)，體係中的 cDNA 即(jí)可(kě)作為 qPCR 的模板(bǎn)進行擴增。

四， 常見(jiàn)問題(tí)與注意(yì)事項(xiàng) (FAQ)

• gDNA 去除(chú)不(bù)ce底
  ：

  如(rú)果(guǒ)在無逆(nì)轉(zhuǎn)錄酶(méi)的(dí)對照(zhào)（No-RT Control）中檢測(cè)到擴(kuò)增(zēng)信(xìn)號，說明 gDNA 殘(cán)留。Takara RR036A 說(shuō)明(míng)書(shū) 建(jiàn)議，可能(néng)是 gDNA Erase 保存不當(dāng)失活，或(huò)者(zhě) RNA 樣本中 DNA 汙(wū)染(rǎn)過於嚴重(zhòng)。此時建議增加(jiā) gDNA Erase 的用(yòng)量(liáng)或延長處(chǔ)理時間。

• 逆(nì)轉錄效(xiào)率低
  ：

  可能是 RNA 模板(bǎn)存在嚴重的二級結(jié)構或含有(yǒu)抑製劑。嘗(cháng)試提高逆轉(zhuǎn)錄溫度（如(rú)使(shǐ)用(yòng) 42°C-50°C）或(huò)稀釋 RNA 模板可能(néng)有(yǒu)所幫(bāng)助(zhù)。

• 引物選(xuǎn)擇策(cè)略
  ：

  對於長(cháng)片(piàn)段(duàn) RNA（>5kb）或(huò)結構復(fù)雜(zá)的 RNA，Takara RR036A 說明書(shū) 推薦使(shǐ)用(yòng) Random 6 mers 或(huò) Oligo dT Primer 與 Random 6 mers 的混合物，以獲得(dé)全長(cháng)度的 cDNA。

• 試劑凍融
  ：

  說明(míng)書(shū)建(jiàn)議將(jiāng)酶類(lèi)分裝後(hòu)避光(guāng)保(bǎo)存(cún)於 -20°C，避(bì)免反(fǎn)復(fù)凍融(róng)導致(zhì)活性(xìng)下降。

五， 總(zǒng)結(jié)

天津益(yì)元利康生物科(kē)技(jì)有限公司(sī) 專(zhuān)注(zhù)於(yú)為國(guó)內生(shēng)命(mìng)科學研究(jiū)提(tí)供高品(pǐn)質(zhì)的分子(zǐ)生物(wù)學試(shì)劑(jì)。作(zuò)為專(zhuān)業(yè)的供應商，天(tiān)津(jīn)益元(yuán)利康(kāng)深知優質(zhì)試(shì)劑對(duì)實(shí)驗成(chéng)功(gōng)的重要性。我們原廠正品供(gōng)應(yīng) Takara Takara RR036A (PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)，確保產品在(zài)效期內(nèi)並通過專業的冷鏈物流(liú)送達(dá)您(nín)的(dí)實驗室(shì)。如果您(nín)在(zài)查(chá)閱(yuè) Takara RR036A 說(shuō)明書(shū) 或操作(zuò)過(guò)程中遇到任何疑問，我們(mén)的技術(shù)支持(chí)團隊(duì)隨時(shí)準(zhǔn)備為您(nín)提供(gōng)專(zhuān)業的解(jiě)答與幫(bāng)助。選擇(zé) 天津益(yì)元(yuán)利(lì)康(kāng)，讓您(nín)的(dí)分子生物(wù)學(xué)實驗更加精(jīng)準(zhǔn)，高效(xiào)。