原(yuán)理(lǐ)

Trizol 是一種新(xīn)型總(zǒng) RNA 抽(chōu)提試(shì)劑，采用(yòng)變(biàn)性劑(jì)即內(nèi)含異硫氰酸胍(guā)酚(fēn)和(hé) β-巰基乙醇(chún)等變性物質(zhì)，能迅速(sù)破碎(suì)細胞，抑製(zhì)細(xì)胞釋(shì)放(fàng)出的核酸(suān)酶(méi)。異(yì)硫氰酸胍(guā)屬於(yú)解偶劑，是一類(lèi)強力(lì)的蛋白質(zhì)變性劑，可(kě)溶解(jiě)蛋白(bái)質，並(bìng)使(shǐ)蛋白質二級結構消(xiāo)失(shī)，細(xì)胞結(jié)構降解，核(hé)蛋白迅速與核(hé)酸(suān)分(fēn)離(lí)。β-巰基(jī)乙(yǐ)醇(chún)主(zhǔ)要(yào)破(pò)壞(huài) RNase 蛋白質中(zhōng)的(dí)二硫鍵(jiàn)。細胞裂解後，細(xì)胞釋放出蛋白質(zhì)，DNA，RNA 等(děng)物質(zhì)，再(zài)根據(jù)它們(mén)在不同(tóng)的 PH 值(zhí)和不(bù)同(tóng)極(jí)性(xìng)溶(róng)劑(jì)的溶解(jiě)度(dù)不(bù)同而使(shǐ)得分開。

材料與儀器(qì)

儀(yí)器
：細(xì)胞樣品，TRIzol 試劑，氯(lǜ)仿，異(yì)丙(bǐng)醇，75% 乙醇(chún)，DEPC，H2O
材料(liào)
：離心管，離心(xīn)機(jī)，EP 管，匀漿(jiāng)器，移(yí)液管(guǎn)，冰袋(dài)，漩(xuán)渦振蕩器

步驟

1. 樣品處理(lǐ)
：

（1） 培養(yǎng)細胞
：收(shōu)獲(huò)細胞 1~5 × 107，移入 1.5 mL 離心(xīn)管中，加入 1 mL Trizol，混匀，室溫靜置 5 min。

（2） 組織
：取 50~100 mg 組織(zhī)（新鮮或 -70 ℃ 及(jí)液氮(dàn)中保存(cún)的組織均可(kě)）置 1.5 mL 離心管(guǎn)中，加入(rù) 1 mL Trizol 充(chōng)分匀漿，室(shì)溫靜置 5 min。

2. 加入 0.2 mL 氯仿(fǎng)，振(zhèn)蕩 15 s，靜置(zhì) 2 min。

3. 4 ℃ 離心，12000 g × 15 min，取上清(qīng)。

4. 加入(rù) 0.5 mL 異(yì)丙醇，將管中液體(tǐ)輕輕(qīng)混匀，室(shì)溫(wēn)靜置 10 min。

5. 4 ℃ 離(lí)心(xīn)，12000 g × 10 min，棄上(shàng)清(qīng)。

6. 加入 1 mL 75% 乙(yǐ)醇，輕(qīng)輕(qīng)洗滌(dí)沉(chén)澱(diàn)。4 ℃，7500 g × 5 min，棄上(shàng)清(qīng)。

7. 晾幹，加入(rù)適量的(dí) DEPC H2O 溶(róng)解(jiě)（65 ℃ 促溶(róng) 10~15 min）

注(zhù)意事項

1. 樣(yàng)品(pǐn)量和 Trizol 的加(jiā)入量一(yī)定要(yào)按步(bù)驟（1）的比例(lì)，不能隨(suí)意(yì)增(zēng)加(jiā)樣品量或減少(shǎo) Trizol 量，否則會(huì)使內源性(xìng) RNase 的抑製不wan全(quán)，導致 RNA 降解。

2. 實(shí)驗過程必(bì)須嚴格防止(zhǐ) RNsae 的(dí)汙(wū)染。

常見(jiàn)問題(tí)

1. RNA 的定量計算(suàn)
：

RNA 定(dìng)量(liáng)方法(fǎ)與(yǔ) DNA 定(dìng)量相似，RNA 在(zài) 260 nm 波(bō)長處有(yǒu)最大(dà)的吸(xī)收(shōu)峰。因(yīn)此，可(kě)以(yǐ)用(yòng) 260 nm 波長分(fēn)光(guāng)測(cè)定 RNA 濃(nóng)度，OD 值(zhí)為 1 相當於(yú)大約 40 μg/mL 的單(dān)鏈 RNA。如(rú)用 1 cm 光徑(jìng)，用 ddH2O 稀(xī)釋(shì) DNA 樣品 n 倍(bèi)並以(yǐ) ddH2O 為空(kōng)白(bái)對照(zhào)，根(gēn)據此(cǐ)時讀出的(dí) OD260 值即可計算(suàn)出(chū)樣(yàng)品(pǐn)稀(xī)釋(shì)前(qián)的濃(nóng)度(dù)
：RNA（mg/mL） = 40 × OD260 讀數 × 稀釋倍數(shù)（n） / 1000。

2. RNA 的(dí)純度(dù)
：
RNA 純品的 OD260/OD280 的比值(zhí)為 2.0，故根據 OD260/OD280 的(dí)比值可以(yǐ)估計 RNA 的純度。

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