簡(jiǎn)介

獲得高質量和(hé)完(wán)整的(dí) RNA 是(shì)很多(duō)分(fēn)子生物學(xué)實驗中最重要(yào)的(dí)一步(bù)，當前(qián)應用最多(duō)的是 Trizol/氯仿萃(cuì)取(qǔ)的方法(fǎ)。

原(yuán)理(lǐ)

1，４℃ 預冷離心機(jī);

2，取(qǔ)出培(péi)養皿，在超淨台中(zhōng)去除(chú)培(péi)養基(jī)，按照每(měi) 1x107 細(xì)胞加(jiā)入 １ｍL Trizol 試(shì)劑，用槍頭吹打充分(fēn)裂解細胞(bāo);

3，將細胞(bāo)裂解液轉移到 1.5 mL 無 RNA 酶的 EP 管中，向每(měi)個 EP 管中(zhōng)加入（1/5 Trizol 體積(jī)的）200 μL 氯仿，上(shàng)下翻轉充(chōng)分混合後，室(shì)溫(wēn)靜置(zhì) 10 分鐘，使核(hé)酸蛋白(bái)復合物(wù)wan全(quán)解(jiě)離;

4，在(zài) ４℃ 下 12000 g 離(lí)心 15 分(fēn)鐘;

5，離(lí)心後，將(jiāng)上(shàng)層(céng)水(shuǐ)相（約 1/2 Trizol體積(jī)）小心轉(zhuǎn)移到一個新(xīn)的(dí) EP 管，加入等體(tǐ)積異(yì)丙醇，震蕩後室溫靜(jìng)置(zhì) 5-10 分(fēn)鐘(zhōng)，然後 12000 g 4℃ 離(lí)心 15 分鐘，棄(qì)上清保(bǎo)留(liú)沉澱;

6，加(jiā)入1 mL 75％ 乙(yǐ)醇(chún)清(qīng)洗並(bìng)沉澱 RNA，12000 g 離心(xīn) 10 分(fēn)鐘;

7，棄(qì)上清，並重復(fù)上述(shù)操(cāo)作一次(cì);

8，棄(qì)上(shàng)清，在超淨工作台中(zhōng)打(dǎ)開 EP 管蓋(gài)，風幹(gān) 5-10 分(fēn)鐘，不(bù)需(xū)wan全幹燥(zào);

9，視沉澱(diàn)的(dí)量，加入 10-30 μL RNase-Free 的(dí) DEPC 雙(shuāng)蒸(zhēng)水(shuǐ)中;

10，待(dài)沉(chén)澱(diàn)溶(róng)解後，用 nanodrop 測定其(qí)濃(nóng)度和(hé)純(chún)度並(bìng)作(zuò)標記，進(jìn)行下(xià)遊實(shí)驗，多餘(yú)的RNA 保存於 -80℃ 冰(bīng)箱。

用(yòng)途

RT-PCR，分(fēn)子(zǐ)克(kè)隆，Northern-Blot，RNA 體(tǐ)外轉錄與(yǔ)翻譯等(děng)。

材(cái)料(liào)與儀器

【材料(liào)】：細胞(bāo)；Trizol 試(shì)劑；氯仿(fǎng)；異(yì)丙醇；75％ 乙醇（使用 RNase-Free 水配製(zhì)）；RNase-Free 水(shuǐ)。

【物(wù)品(pǐn)及儀器】：1.5 ml EP管(guǎn)（RNA-free），大(dà)，中(zhōng)，小(xiǎo)號(hào)槍(qiāng)頭（RNA-free），移(yí)液器，渦(wō)旋(xuán)振蕩(dàng)器，高速冷(lěng)凍(dòng)離心機(jī)，超(chāo)淨工作台。

步驟(zhòu)

1，４℃ 預冷離心(xīn)機(jī);

2，取(qǔ)出(chū)培(péi)養皿，在(zài)超淨(jìng)台(tái)中去除培(péi)養基，按照每(měi) 1x107 細(xì)胞(bāo)加入 １ｍL Trizol 試(shì)劑，用(yòng)槍(qiāng)頭吹打(dǎ)充(chōng)分裂解細胞;

3，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移(yí)到 1.5 mL 無(wú) RNA 酶的 EP 管(guǎn)中，向(xiàng)每個 EP 管(guǎn)中(zhōng)加入(rù)（1/5 Trizol 體積(jī)的）200 μL 氯(lǜ)仿(fǎng)，上下(xià)翻轉充(chōng)分混合後，室(shì)溫(wēn)靜置(zhì) 10 分(fēn)鐘，使核酸(suān)蛋白(bái)復合物(wù)wan全解離;

4，在 ４℃ 下 12000 g 離(lí)心 15 分鐘(zhōng);

5，離(lí)心後(hòu)，將上層(céng)水(shuǐ)相（約 1/2 Trizol體積(jī)）小心轉移到(dào)一(yī)個新的(dí) EP 管，加入(rù)等體(tǐ)積異丙(bǐng)醇，震蕩後(hòu)室溫(wēn)靜置 5-10 分鐘，然後 12000 g 4℃ 離心(xīn) 15 分鐘，棄上清(qīng)保留沉(chén)澱;

6，加入1 mL 75％ 乙醇(chún)清洗並沉(chén)澱(diàn) RNA，12000 g 離心(xīn) 10 分(fēn)鐘;

7，棄上清，並(bìng)重復上(shàng)述(shù)操(cāo)作(zuò)一次(cì);

8，棄上(shàng)清，在超(chāo)淨(jìng)工作台(tái)中(zhōng)打開(kāi) EP 管蓋，風幹 5-10 分鐘(zhōng)，不需wan全幹燥;

9，視沉澱的量(liáng)，加入(rù) 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 雙(shuāng)蒸水中(zhōng);

10，待沉澱溶(róng)解後，用 nanodrop 測定其濃(nóng)度(dù)和純(chún)度(dù)並(bìng)作(zuò)標記，進(jìn)行(háng)下遊(yóu)實驗(yàn)，多餘(yú)的(dí)RNA 保存於(yú) -80℃ 冰箱。

注意事(shì)項

1，過程中需佩戴口(kǒu)罩(zhào)和新手(shǒu)套(tào)，對台(tái)麵以及周圍環(huán)境(jìng)進行滅(miè)酶處(chǔ)理，盡(jìn)量(liáng)在超淨台中(zhōng)進(jìn)行操作(zuò)；

2，使用無 Rnase 的(dí)塑料製品和槍頭(tóu)，避(bì)免(miǎn)交叉(chā)汙染。

3，溶液(yè)配(pèi)製應使(shǐ)用無 Rnase 的(dí)水，（將(jiāng)水加入到幹(gān)淨(jìng)的(dí)玻(bō)璃(lí)瓶中(zhōng)，加入(rù) DEPC 至終濃度(dù)為 0.1%（V/V)，放置(zhì)過(guò)夜(yè)，高壓(yā)滅菌。注：DEPC 有致(zhì)癌之嫌，須小(xiǎo)心操作(zuò)）。

4，Trizol 裂解液非常危險，因小心(xīn)避(bì)免濺到身上，台麵上的(dí) Trizol 要及時清(qīng)理幹(gān)淨。

常(cháng)見問(wèn)題

RNA 得率(shuài)過(guò)低(dī)：

1.使(shǐ)用更(gēng)有效的破碎/匀(yún)漿(jiāng)方(fāng)法(fǎ)。如液氮(dàn)搗碎，酶(méi)消化(huà)破壁，電動(dòng)匀漿器匀漿(jiāng)；

2.更換(huàn)抽提試劑；

3.核酸濃(nóng)度低(dī)時，采(cǎi)用(yòng)低(dī)溫沉(chén)澱(diàn)，並(bìng)延長沉澱時間(jiān)；

4.增加(jiā)細胞(bāo)。

RNA 質量(liáng)不高：

1，取上(shàng)層水相時求(qiú)多(duō)，吸到(dào)了下層(céng)有機相；

2，清洗不幹淨。

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