簡(jiǎn)介(jiè)

16 SrRNA PCR在(zài)臨(lín)床(chuáng)診(zhěn)斷(duàn)及(jí)流(liú)行病調(tiáo)查中的應(yīng)用(yòng)是采(cǎi)用(yòng)16S rRNA基(jī)因克隆文庫(kù)的(dí)方法分(fēn)析(xī)菌(jūn)群組(zǔ)成(chéng)已廣泛應(yīng)用於環(huán)境(jìng)和臨(lín)床微(wēi)生(shēng)物中，它(tā)既(jì)可以(yǐ)分析(xī)標(biāo)本(běn)中細菌的(dí)種類，又(yòu)可以反(fǎn)映(yìng)標本中各種細(xì)菌(jūn)的(dí)相(xiāng)對比(bǐ)例(lì)，可以相對定量。

原理

16 SrRNA PCR在(zài)臨床診(zhěn)斷及(jí)流(liú)行(háng)病(bìng)調查中(zhōng)的應(yīng)用(yòng)的(dí)基(jī)本原(yuán)理(lǐ)是細菌的(dí)核糖(táng)體RNA (rRNA)按沉降(jiàng)係(xì)數分為5S，16S 和23S,其編(biān)碼基(jī)因(yīn)(rDNA) 長(cháng)度依次(cì)為(wéi)120個，1540個及3300個(gè)核(hé)苷(gān)酸。

典(diǎn)型(xíng)的原(yuán)核生物(wù)大腸杆菌(jūn)核(hé)糖體是(shì)由50S大亞基(jī)和(hé)30S小亞基組(zǔ)成(chéng)的。在(zài)完整(zhěng)的(dí)核(hé)糖體中，rRNA約(yuē)占2/3,蛋白(bái)質約(yuē)為1/3。50S大亞(yà)基含有34種(zhǒng)不同(tóng)的蛋白質(zhì)和兩(liǎng)種RNA分(fēn)子，相對分(fēn)子質(zhì)量大的(dí)rRNA的沉降(jiàng)係數(shù)為(wéi)23S,相對分子質量(liáng)小(xiǎo)的rRNA為(wéi)5S。

30S小(xiǎo)亞(yà)基含有21種蛋(dàn)白質和一一個(gè)16S的rRNA分子。rRNA基因(yīn)由保守(shǒu)區(qū)和(hé)可變區組成，在(zài)細(xì)菌(jūn)中(zhōng)高(gāo)度(dù)保守(shǒu)。rRNA基因(yīn)包含(hán)5'端(duān)到(dào)3'端的若(ruò)幹種成分，分別是(shì)16S rDNA，間區，23SrDNA，間區和5SrDNA。

16SrDNA基(jī)因是(shì)細菌染色(sè)體上編碼16SrRNA相對應的DNA序列，它(tā)集(jí)保(bǎo)守(shǒu)性和變異性(xìng)於一身，存(cún)在(zài)於(yú)所(suǒ)有細菌的染色體基因(yīn)組中。

用(yòng)途(tú)

16 SrRNA PCR可(kě)用(yòng)於細菌的(dí)檢測，鑒(jiàn)定(dìng)，監測及(jí)係統進(jìn)化研究(jiū)。

材料與(yǔ)儀器

器材(cái)：臨床(chuáng)標(biāo)本DNA/RNA提取(qǔ)試劑(jì)盒，細菌基(jī)因組(zǔ)提(tí)取試劑(jì)盒，普(pǔ)通(tōng)PCR試劑盒，熒光(guāng)定(dìng)量PCR試劑盒(hé)，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，PCR產物回收(shōu)試劑(jì)盒(hé)，DNA測序(xù)儀等(děng)。

步驟(zhòu)

獲得(dé)目的(dí)16S rDNA有兩種方(fāng)法(見圖12-6)。

（一）從(cóng)基因組直(zhí)接擴(kuò)增法(fǎ)

A. 從微生物樣品中(zhōng)直接(jiē)提(tí)取(qǔ)總(zǒng)DNA對(duì)已(yǐ)知(zhī)的純培養(yǎng)的微(wēi)生物可(kě)通過培養富(fù)集後再進行提取。

①細菌培養(yǎng):將細菌接種(zhǒng)於(yú)5 ml液(yè)體培(péi)養基中，37 °C搖(yáo)床(chuáng)(300 r/min) 培養過(guò)夜(yè)。
②細菌收集:取(qǔ)1 ml培養物(wù)於1.5 mlEP管中，室溫8000 r/min離心5 min,棄上(shàng)清，沉澱重新懸浮於(yú)1 ml TE (pH8.0)中(用ddH2O也行)。
③菌(jūn)體(tǐ)裂(liè)解:加(jiā)入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶，37 °C作用2 h。

再(zài)加(jiā)2 mol/L NaCl 50 μl，10% SDS 110 μl，20 mg/ml 的(dí)蛋白酶(méi)K 3 μl，50 °C作用3 h或37 °C過(guò)夜(yè)。(此時菌(jūn)液應(yīng)為透明黏(nián)稠液體)
④抽提:菌液均(jūn)分(fēn)到兩個1. 5 ml EP管，加等(děng)體積的(dí)酚~氯仿-異戊(wù)醇(chún)(25 : 24 : 1)，混匀(yún),室溫(wēn)放置5~ 10 min。

12000 r/min 離心10 min。 抽(chōu)提兩次。(上清(qīng)很黏(nián)稠(chóu)，吸(xī)取(qǔ)時應小心，最(zuì)好槍頭尖應剪(jiǎn)去(qù))
⑤沉澱(diàn):加(jiā)0. 6倍(bèi)體(tǐ)積(jī)的異(yì)丙醇(chún)，混匀(yún)，室溫放置(zhì)10 min。12000 r/min 離心(xīn)10 min。
⑥洗滌(dí):沉澱(diàn)用75% 的(dí)乙醇洗(xǐ)滌。
⑦抽(chōu)(涼(liáng))幹後，溶於50 μlddH2O中(zhōng)，取2~5 μl電(diàn)泳(yǒng)。作PCR模板用。

此(cǐ)外(wài)也可使用市(shì)售細(xì)菌(jūn)基因組DNA提取試劑盒獲得較純(chún)的(dí)基(jī)因組DNA。

B.從醫(yī)學(xué)標(biāo)本或(huò)樣(yàng)品中(zhōng)提(tí)取基(jī)因組DNA如(rú)果(guǒ)提(tí)供(gōng)的材(cái)料(liào)是醫(yī)學標本(běn)或樣(yàng)品(pǐn)則(zé)直接提取(qǔ)基因組(zǔ)DNA而不(bù)要培(péi)養，此(cǐ)方法如(rú)下:
液體標本高(gāo)速(sù)離(lí)心(12000 r/min) 10min， 沉(chén)澱加50μl“標(biāo)本預處(chǔ)理液"，37 °C 孵(fū)育30 min,12000r/ min離心(xīn)10 min,沉澱(diàn)待(dài)用;組織標本直接加(jiā)等(děng)量(liáng)“標本預處理液(yè)"，操(cāo)作(zuò)同上(shàng)述。

處(chǔ)理(lǐ)後的標(biāo)本加(jiā)入(rù)30 μl專用裂解(jiě)試劑(可購自北(běi)京美(měi)萊博(bó)醫學技術有限公司(sī))，振(zhèn)蕩儀(yí)上振蕩(dàng)5 min,使標本(běn)與試劑充分(fēn)混(hùn)合，然(rán)後煮沸10 min，使(shǐ)標(biāo)本中(zhōng)的核酸(suān)物質che底釋(shì)放並溶解在(zài)緩(huǎn)衝液(yè)中(zhōng);離(lí)心(xīn)後上(shàng)清(qīng)即(jí)可進行PCR。

C.PCR擴增(zēng)rDNA對已知的純(chún)培養(yǎng)的微(wēi)生(shēng)物可(kě)以設計特(tè)異引物，在GenBank搜(sōu)索同種的菌(jūn)種的rDNA序列(liè)，一(yī)般(bān)同(tóng)種(zhǒng)的 rDNA序列(liè)有99% 以上的(dí)-致(zhì)性。設(shè)計好的引(yǐn)物通(tōng)過BLAST比(bǐ)對驗證其特異性。
對(duì)醫(yī)學標(biāo)本(běn)或樣(yàng)品則(zé)可(kě)設計(jì)通用(yòng)引物(wù)擴增(zēng)目(mù)的16S rDNA。

如:
正(zhèng)向引(yǐn)物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
反向(xiàng)引(yǐn)物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

D.純(chún)化凝(níng)膠(jiāo)電(diàn)泳檢測(cè)後 可(kě)使用(yòng)PCR產物純化(huà)試(shì)劑盒(hé)純(chún)化(huà)擴增(zēng)DNA。

（二）rRNA反轉(zhuǎn)錄(lù)法(fǎ)

A. 取(qǔ)16SrDNA序(xù)列的方法能(néng)夠(gòu)區分(fēn)被(bèi)檢(jiǎn)測的(dí)細胞是否為(wéi)活體細胞。對未知序(xù)列的rRNA要(yào)測(cè)序，應該(gāi)對目(mù)的(dí)rRNA進(jìn)行純(chún)化。

B.以同(tóng)源(yuán)已知(zhī)的rRNA序列為模(mó)板設(shè)計(jì)引物，RT-PCR獲得c-rDNA再測(cè)序。.

C.CDNA的(dí)合成。反轉錄(lù)體係共20μl,包括細胞總RNA 2 μg/2μl, 50 U/μl Rnasin 1 μl，5×反轉(zhuǎn)錄(lù)反應緩(huǎn)衝(chōng)液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl，50 μg/ml 隨(suí)機引物2 μl，200 U/μl M-MLV反轉(zhuǎn)錄(lù)酶1μl, DEPC 8 μl。37 ℃反應60 min，95 °C 5 min終(zhōng)止反(fǎn)應(yīng)。cDNA 在- 80 °C 保存(cún)或(huò)進行PCR擴增。

注(zhù)意事(shì)項(xiàng)：如果實驗(yàn)對象(xiàng)是(shì)純(chún)培(péi)養(yǎng)物(wù)，則可(kě)以(yǐ)按上(shàng)述方(fāng)法獲得rDNA後(hòu)直(zhí)接(jiē)測序。對於從樣(yàng)品(pǐn)標本(běn)中(zhōng)獲得(dé)的rDNA,需構(gòu)建16S rDNA文庫，然(rán)後挑取單(dān)克隆(lóng)測序(xù)。

注(zhù)意事(shì)項

1.采用PCR技術(shù)可(kě)以一(yī)-次性從(cóng)混合(hé)DNA或RNA樣品中(zhōng)擴(kuò)增(zēng)出16SrRNA序列(liè)，但也(yě)同(tóng)樣會出(chū)現(xiàn)PCR所固有的(dí)缺點(diǎn)，尤(yóu)其是采用16SrRNA保守序列的通用(yòng)引物對多種微(wēi)生物(wù)混合樣(yàng)品進(jìn)行擴(kuò)增(zēng)，可能出(chū)現嵌(qiàn)合產物(wù)(chimeric product)和擴(kuò)增偏(piān)嗜性現象。

2.采用16SrRNA基(jī)因克隆文(wén)庫的方法分析(xī)菌群(qún)組成(chéng)，既可以分(fēn)析標(biāo)本(běn)中細(xì)菌(jūn)的種類，又(yòu)可(kě)以反映標(biāo)本中各(gè)種細(xì)菌的相(xiāng)對比例，可以(yǐ)相(xiāng)對定(dìng)量。但不是(shì)絕對定(dìng)量，即(jí)標本中菌(jūn)群的(dí)比例與克(kè)隆(lóng)文(wén)庫中(zhōng)對應(yīng)單克隆的(dí)比(bǐ)例(lì)相(xiāng)關(guān)，但(dàn)不是直(zhí)綫相(xiāng)關。

3.16SrDNA基因克(kè)隆文庫(kù)不(bù)能(néng)完(wán)quan反映標本的真實(shí)情況，有些細(xì)菌(jūn)的比例(lì)太低，或有(yǒu)的(dí)細菌的rDNA不(bù)能用通(tōng)用引物擴(kuò)增(zēng)出來而無法在克隆文庫中出現(xiàn)。前者(zhě)可(kě)通(tōng)過(guò)加(jiā)大文庫量(liáng)來(lái)解決(jué)，後(hòu)者可(kě)通(tōng)過(guò)設計(jì)兼(jiān)並引(yǐn)物和多對引物同時使用部(bù)分解決。