q是指在PCR體(tǐ)係(xì)中加入(rù)熒光染(rǎn)料或熒(yíng)光探針，利用(yòng)熒光信(xìn)號積(jī)累(léi)實時監(jiān)測整(zhěng)個PCR進(jìn)程，通(tōng)過C-值(zhí)和標準曲(qū)綫(xiàn)對未知模板(bǎn)進(jìn)行(háng)定(dìng)量(liáng)分析的(dí)方法(fǎ)。那麼你(nǐ)知道qPCR實驗的注意事項有(yǒu)哪(nǎ)些嗎？讓(ràng)我(wǒ)們(mén)一起(qǐ)來看看(kàn)吧！
 

　　一，模板製備
 

　　在(zài)進行qPCR實驗時，需要根據(jù)所(suǒ)用(yòng)試(shì)劑盒說明書加(jiā)入(rù)適(shì)量的(dí)起(qǐ)始核酸(suān)模板，過(guò)多(duō)的模板(bǎn)可能(néng)提高汙染物含量(liáng)，大大(dà)降(jiàng)低 PCR 效(xiào)率(shuài)，過(guò)少(shǎo)的(dí)模板可能(néng)會降低檢測靈敏性(xìng)和(hé)重復性。
 

　　根(gēn)據檢(jiǎn)測靶(bǎ)標的性(xìng)質特(tè)點，選擇合適(shì)的核酸抽提試劑盒同樣至關重(zhòng)要(yào)。小(xiǎo)編(biān)有遇到老師想要通(tōng)過(guò)qPCR的(dí)方法(fǎ)完成(chéng)對microRNA的(dí)定量(liáng)，但是(shì)發(fā)現待檢(jiǎn)測樣(yàng)本(běn)中(zhōng)目標microRNA和內參基因(yīn)的(dí)擴增曲綫出峰時間都比(bǐ)較(jiào)晚，內(nèi)參基(jī)因的Ct值甚至大於30(圖2)。排除(chú)實驗操作(zuò)問題後(hòu)發現(xiàn)原來是因(yīn)為(wéi)所(suǒ)使用RNA抽提試劑盒對小片段(duàn)的microRNA回(huí)收(shōu)效率(shuài)低(dī)，不適(shì)合用於下(xià)遊(yóu)microRNA定(dìng)量實驗(yàn)。
 

　　二(èr)，引物(wù)探(tàn)針的(dí)設計(jì)及(jí)儲存
 

　　除了要保證模板(bǎn)的質量外，引物探針的(dí)設(shè)計(jì)和穩定性同(tóng)樣(yàng)至關重(zhòng)要(yào)。當我們根(gēn)據(jù)檢(jiǎn)測(cè)靶標設(shè)計特(tè)異(yì)性引(yǐn)物和探針(zhēn)時，除(chú)了要考(kǎo)慮片(piàn)段長度，Tm值，鹼(jiǎn)基組成(chéng)等基本(běn)要點外，還需格外(wài)注意引(yǐn)物(wù)，探針(zhēn)自身不能(néng)形成復(fù)雜(zá)的二級結構，上(shàng)下遊引物內部，引物探針之間不能(néng)出(chū)現結合的現象，因為(wéi)這些(xiē)都可能(néng)影響引物探針與(yǔ)目標(biāo)基(jī)因(yīn)的(dí)結合(hé)，進(jìn)而(ér)影響擴增效率。
 

　　除了引物(wù)探(tàn)針在設計時需要(yào)格(gé)外花費(fèi)心思(sī)外，收到合(hé)成好(hǎo)的(dí)引物，探針(zhēn)如何(hé)稀(xī)釋(shì)，如何保(bǎo)存(cún)同樣有小tips。如果(guǒ)我(wǒ)們合(hé)成(chéng)的引(yǐn)物(wù)探針是(shì)幹粉(fěn)狀或(huò)是(shì)需要(yào)稀(xī)釋時(shí)，為了(liǎo)保(bǎo)證(zhèng)引(yǐn)物探針的(dí)穩(wěn)定性建議用1×TE buffer去溶解和稀(xī)釋。另(lìng)外，引(yǐn)物的(dí)儲存濃(nóng)度(dù)也可(kě)能(néng)影響其(qí)穩定性，建議引(yǐn)物(wù)的(dí)儲存濃度不低於 10 μM，一(yī)般為(wéi)100 μM 。此外如果引物(wù)和(hé)探針(zhēn)每次使用量較少時(shí)，還應(yīng)該(gāi)進行分(fēn)裝(zhuāng)，保存(cún)在-20℃，以減少反(fǎn)復凍(dòng)融的次數。
 

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