什麼是轉(zhuǎn)膜與顯色(sè)
 

　　WB 是(shì)進(jìn)行(háng)蛋(dàn)白(bái)質分析是流行和(hé)成熟(shú)的(dí)技術(shù)之(zhī)一(yī)，全(quán)稱(chēng)為(wéi)蛋白質(zhì)免疫(yì)印跡，是將(jiāng)蛋白質轉移到膜上(shàng)，然(rán)後利(lì)用抗(kàng)體(tǐ)進(jìn)行檢測的方(fāng)法(fǎ)那麼你知(zhī)道(dào)在(zài)WB實驗中什(shí)麼是轉膜(mó)與(yǔ)顯色(sè)嗎(má)？讓我(wǒ)們一(yī)起來看(kàn)看吧！
 

　　電泳(yǒng)後(hòu)檢(jiǎn)測蛋(dàn)白(bái)是(shì)否(fǒu)遷移正(zhèng)確(què)與平均(jūn)，可(kě)采用鋅染(rǎn)(負(fù)染)，膠(jiāo)染(rǎn)(blue silver)或考馬斯藍(lán)染(rǎn)色檢測，如(rú)果凝膠(jiāo)中的蛋(dàn)白(bái)需要進行(háng)轉(zhuǎn)膜則(zé)需可逆(nì)的(dí)鋅染(rǎn)法，否則可以采用(yòng)不可(kě)逆考馬(mǎ)斯亮(liàng)藍法(fǎ)染色。雜交膜的(dí)選擇是決定(dìng) Western blot 成敗的重要(yào)環節。應根據雜交方(fāng)案，被轉(zhuǎn)移(yí)蛋白的特性(xìng)以(yǐ)及(jí)分子大小等因素，選擇(zé)合(hé)適材質，孔(kǒng)徑和(hé)規格(gé)的(dí)雜交(jiāo)膜。
 

　　用於 Western blot 的(dí)膜主要有兩種(zhǒng)：硝酸(suān)纖(xiān)維素膜(NC) 和(hé)PVDF 膜(mó)。膜是蛋白印(yìn)跡(jì)實驗的(dí)標準(zhǔn)固相(xiāng)支持物(wù)，在低離子轉移(yí)緩(huǎn)衝液(yè)的(dí)環境下(xià)，大多數帶(dài)負電荷的蛋白質(zhì)會與膜(mó)發(fā)生(shēng)疏水作用(yòng)而(ér)高(gāo)親(qīn)和(hé)力(lì)的結合(hé)在(zài)一起(qǐ)，但(dàn)在非離子型的去汙劑作用下(xià)，結合的(dí)蛋白(bái)還可以被洗脫下來(lái)。根(gēn)據(jù)被轉移的蛋白(bái)分(fēn)子(zǐ)量大小，選(xuǎn)擇不同孔徑的(dí)膜。因為隨(suí)著(zhuó)膜孔(kǒng)徑(jìng)的(dí)不斷減小，膜(mó)對(duì)低分子(zǐ)量(liáng)蛋白的結合(hé)就(jiù)越牢固(gù)。通(tōng)常用 0.45μm 和 0.2μm 兩種(zhǒng)規(guī)格(gé)的膜。大(dà)於20kD 的(dí)蛋白(bái)可(kě)用 0.45μm 的膜，小(xiǎo)於(yú)20kD 的蛋(dàn)白就(jiù)要(yào)用(yòng) 0.2μm 的膜(mó)了(liǎo)，如用(yòng) 0.45μm 的膜就會(huì)發(fā)生(shēng)“Blowthrough”的現象。常(cháng)用於 Western Blot 的轉移(yí)膜主(zhǔ)要是(shì)硝酸(suān)纖維(wéi)素(sù)(Nitrocellulose, NC)膜和(hé)聚偏(piān)二氟乙(yǐ)烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此(cǐ)外(wài)也有(yǒu)用尼龍(lóng)膜(mó)，DEAE 纖(xiān)維(wéi)素膜做蛋(dàn)白印(yìn)跡。尼龍膜(mó)和 NC 膜的(dí)特點相(xiāng)似(sì)，主(zhǔ)要(yào)用於(yú)核酸雜(zá)交(jiāo)。雜(zá)交膜上有很(hěn)多(duō)非特(tè)異性(xìng)的蛋白質結(jié)合位(wèi)點，為防(fáng)止這(zhè)些位(wèi)點與抗(kàng)體結合(hé)引(yǐn)起非特異的染色(sè)和(hé)背景(jǐng)，一般用惰(duò)性蛋(dàn)白質(zhì)或非(fēi)離(lí)子(zǐ)去汙劑(jì)封閉膜上的(dí)未(wèi)結合(hé)位點(diǎn)來降低(dī)抗體(tǐ)的非特異(yì)性結合。封閉(bì)劑應(yīng)該(gāi)封閉(bì)所(suǒ)有(yǒu)未(wèi)結合位(wèi)點而不替換(huàn)膜上的靶(bǎ)蛋(dàn)白(bái)，不結(jié)合靶蛋白的表位，也(yě)不與抗體(tǐ)或檢(jiǎn)測試(shì)劑(jì)有(yǒu)交(jiāo)叉反(fǎn)應(yīng)。
 

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