抗體是生命(mìng)科學(xué)實驗(yàn)的(dí)“基(jī)石”，但也(yě)是(shì)最容易出問(wèn)題(tí)的(dí)環節(jié)之一。踩中(zhōng)一(yī)個(gè)“雷(léi)區”，就(jiù)可能導致幾(jī)個月(yuè)的心血白費。以(yǐ)下為(wéi)您梳(shū)理了(liǎo)抗體使(shǐ)用過程中(zhōng)最(zuì)常(cháng)見的“雷區”及避坑(kēng)指(zhǐ)南，涵蓋了從(cóng)存儲到(dào)驗證的全流程(chéng)。
 

　　一，
 

　　錯誤做法(fǎ)：
 

　　將濃(nóng)縮(suō)抗體長(cháng)期存放在4°C(非“即用(yòng)型(xíng)”抗體(tǐ))。
 

　　反復凍(dòng)融抗體(tǐ)。
 

　　將分(fēn)裝(zhuāng)抗(kàng)體(tǐ)存(cún)放(fàng)在(zài)冰(bīng)箱(xiāng)門(mén)架上，溫(wēn)度(dù)波(bō)動劇(jù)烈。
 

　　避(bì)坑指(zhǐ)南：
 

　　遵(zūn)循(xún)說(shuō)明(míng)書(shū)! 絕(jué)大(dà)多(duō)數濃縮抗體必(bì)須(xū) -20°C 長(cháng)期保存。
 

 

　　堅(jiān)決分(fēn)裝! 根據(jù)使用頻率，將抗(kàng)體無菌分(fēn)裝成(chéng)小份(如(rú)5-10μL/管)，避免(miǎn)反復(fù)凍融(róng)。
 

　　使(shǐ)用(yòng)抗(kàng)體(tǐ)存儲盒(hé)： 將分裝(zhuāng)管放(fàng)入裝(zhuāng)有(yǒu)異(yì)丙醇(chún)的(dí) -20°C 專用(yòng)抗體存儲(chǔ)盒中(zhōng)，確保(bǎo)溫(wēn)度(dù)穩(wěn)定，避(bì)免(miǎn)冰晶形成。
 

　　工作液(yè)的保存： 稀(xī)釋後的(dí)抗(kàng)體工作(zuò)液(yè)通常(cháng)不(bù)穩(wěn)定，應現(xiàn)用(yòng)現(xiàn)配，或在4°C短(duǎn)期(qī)保(bǎo)存(cún)(1-2周(zhōu))，並加入防腐劑(如0.02% 疊(dié)氮(dàn)化鈉，注(zhù)意(yì)：有(yǒu)毒且會抑製(zhì)某些酶活(huó)性(xìng))。
 

　　二(èr)，
 

　　錯誤做(zuò)法：
 

　　直(zhí)接(jiē)使(shǐ)用(yòng)說(shuō)明書(shū)推薦的(dí)稀(xī)釋度，不(bù)進行梯(tī)度預(yù)實驗(yàn)。
 

　　不(bù)設(shè)置(zhì)或(huò)設置錯(cuò)誤(wù)的陽性(xìng)/陰性對照(zhào)。
 

　　不同(tóng)實(shí)驗類(lèi)型(WB/IHC/IF/FC)使用相同的稀釋度。
 

　　避(bì)坑(kēng)指南：
 

　　必須(xū)進行抗(kàng)體滴(dī)定! 這是最(zuì)重要(yào)的(dí)優化步(bù)驟(zhòu)。在您(nín)的實(shí)驗(yàn)係統下(xià)，做一(yī)個(gè)梯度稀(xī)釋(shì)(如1:100. 1:500. 1:1000. 1:2000)，找到信噪比最(zuì)高(gāo)的最佳稀釋度(dù)。
 

　　設立(lì)嚴謹(jǐn)的(dí)對照：
 

　　陽(yáng)性對(duì)照(zhào)： 已知(zhī)表(biǎo)達目標蛋白的(dí)細(xì)胞係或組織(zhī)。驗(yàn)證實驗體係有效(xiào)。
 

　　陰性(xìng)對照：
 

　　實驗(yàn)陰性對照(zhào)(至關(guān)重要!)： 使用(yòng)同(tóng)型IgG 或 不(bù)含一抗的(dí)緩衝(chōng)液。這是判斷信號特異性(xìng)的金標(biāo)準(zhǔn)。
 

　　生物學(xué)陰性(xìng)對照： 已(yǐ)知不表達(dá)目(mù)標蛋白的細(xì)胞係或組(zǔ)織(如(rú)基(jī)因(yīn)敲除(chú)細胞)。
 

　　明(míng)確應用類型(xíng)： 務必確認抗體適用於您要做(zuò)的(dí)實驗(WB, IHC, IF, FC等(děng))。用(yòng)於WB的(dí)抗體可(kě)能(néng)不適用(yòng)於(yú)IHC，反之亦然。
 

　　三，抗體使(shǐ)用
 

　　錯誤做法(fǎ)：
 

　　WB轉膜不徹底(dǐ)或過轉。
 

　　IHC/IF中抗(kàng)原修復方法或條(tiáo)件錯(cuò)誤(wù)。
 

　　封閉(bì)不充(chōng)分(fēn)或封閉過度。
 

　　洗脫(tuō)不充(chōng)分或過(guò)於劇烈。
 

　　避坑指南：
 

　　WB：
 

　　驗證轉(zhuǎn)膜效率：使(shǐ)用(yòng)可(kě)逆的染(rǎn)液(如麗春紅(hóng)S)或(huò)考(kǎo)馬(mǎ)斯亮藍(lán)染凝膠，確(què)認(rèn)蛋白已轉至(zhì)膜(mó)上(shàng)。
 

　　優化封閉：常(cháng)用5% BSA或(huò)脫(tuō)脂(zhī)牛奶，注(zhù)意磷(lín)酸化(huà)蛋白檢(jiǎn)測需用(yòng)BSA，因(yīn)為(wéi)牛(niú)奶(nǎi)中(zhōng)含有酪(lào)蛋(dàn)白磷酸化。
 

　　IHC/IF：
 

　　優(yōu)化(huà)抗原(yuán)修(xiū)復：根據目標抗(kàng)原選擇檸檬酸鹽(pH6.0) 或 EDTA(pH8.0-9.0) 緩(huǎn)衝液，並優化(huà)加(jiā)熱(rè)時間/壓力(lì)。
 

　　防(fáng)止切(qiē)片(piàn)幹燥：任何時候都不要讓組織切(qiē)片幹(gān)燥(zào)，否則會導致非特異(yì)性背景(jǐng)高。
 

　　充分洗(xǐ)滌(dí)： 使(shǐ)用足夠(gòu)的PBST或TBST，每(měi)次洗(xǐ)滌5分(fēn)鐘(zhōng)，洗3次，去除未結合的抗(kàng)體。
 

　　四(sì)，抗體(tǐ)使用(yòng)
 

　　選(xuǎn)擇(zé)可(kě)靠(kào)品(pǐn)牌： 優先選(xuǎn)擇(zé)CST, Abcam, Thermo Fisher等口碑好的(dí)品牌(pái)。
 

　　查(chá)閱數(shù)據(jù)： 購(gòu)買前(qián)，務(wù)必在(zài)上查看(kàn)該(gāi)抗體的應(yīng)用(yòng)數(shù)據(jù)(WB，IHC等圖片)和(hé)參考文獻。
 

　　利(lì)用引用文(wén)獻： 在(zài)PubMed上(shàng)搜索該(gāi)抗(kàng)體的貨(huò)號，查(chá)看其他(tā)同行在高(gāo)質(zhì)量期刊(kān)中(zhōng)是如何(hé)使用(yòng)和(hé)驗證(zhèng)該(gāi)抗體(tǐ)的(dí)。

 

　　遵循以上(shàng)指(zhǐ)南(nán)，您可(kě)以(yǐ)極大(dà)地避免踩雷(léi)，確(què)保(bǎo)實驗結(jié)果的可(kě)靠(kào)性，可(kě)重復性和科學性。祝您(nín)實(shí)驗順(shùn)利!
 

　　CST, Abcam, Thermo Fisher，Origene，伊萊瑞特代理——天津(jīn)益元利康有(yǒu)限(xiàn)公(gōng)司(sī)，提(tí)供各種(zhǒng)抗體，試劑盒，細(xì)胞，蛋(dàn)白(bái)，耗材(cái)等。該公(gōng)司(sī)是(shì)一家(jiā)專注(zhù)於生(shēng)命科學實(shí)驗(yàn)室快(kuài)速消(xiāo)耗品為主營(yíng)方(fāng)向的(dí)生命(mìng)科技企業(yè)，提(tí)供完整的產品(pǐn)和服務體(tǐ)係(xì)，為(wéi)廣大的科(kē)研用戶提(tí)供(gōng)實驗(yàn)室一站式服務(wù)。益元利康已成為多家生(shēng)物品牌的(dí)代理(lǐ)商，如(rú)ALZET，MedKoo，EZB，WaKo，Zymoresearch，Qiagen等(děng)，為(wéi)用(yòng)戶提供*的產品，專業的咨(zī)詢，助力推動中(zhōng)國生命科學(xué)研究快(kuài)速發展。