原代細(xì)胞(bāo)(primary cell)：是指(zhǐ)從機體的組織(zhī)(如(rú)人組織，小鼠組織，大鼠組織和(hé)兔組織(zhī)等)經蛋(dàn)白(bái)酶或其(qí)它的方(fāng)法獲(huò)得(dé)單個細胞並(bìng)在體外進行(háng)模擬機(jī)體培養的細(xì)胞，稱為原代(dài)細胞。一般(bān)認為(wéi)，培養的原代的(dí)第(dì)1代(dài)細胞和(hé)傳(chuán)代到第(dì)10代(dài)以(yǐ)內的細(xì)胞(bāo)統(tǒng)稱為原代(dài)細胞培養。

原代細(xì)胞(bāo)的(dí)獲取(qǔ)難度大(dà)，需要考慮的問題(tí)多，原(yuán)代細(xì)胞如(rú)何(hé)獲(huò)取？

原代細(xì)胞的獲(huò)取(qǔ)，就是(shì)從活(huó)體(tǐ)上(shàng)將組織(zhī)分解成單(dān)個(gè)細胞再(zài)進(jìn)行(háng)培養的過程，且整個(gè)過(guò)程要(yào)求(qiú)無菌操作(zuò)。具體要(yào)考慮(lǜ)的問題(tí)有：組織(zhī)分解的(dí)方式(shì)，培養(yǎng)的時間(jiān)，換(huàn)液時間(jiān)，細(xì)胞狀(zhuàng)態(tài)判斷和(hé)凍存。

一，組(zǔ)織(zhī)分解(jiě)的方式(shì)

將組織(zhī)分解成(chéng)單(dān)個細胞的方式目(mù)前主要(yào)有兩(liǎng)種：酶(méi)消(xiāo)化法(fǎ)和組織塊(kuài)法（針(zhēn)對(duì)貼(tiē)壁(bì)細胞）。

1. 酶(méi)消化法(fǎ)：所用(yòng)試(shì)劑(jì)：膠原酶和胰酶(méi)。

 膠(jiāo)原酶的選(xuǎn)擇(zé)：（根據(jù)自己(jǐ)的組織樣本選擇合(hé)適(shì)的(dí)膠(jiāo)原酶是(shì)實驗(yàn)成功(gōng)的大前提(tí)。）

膠(jiāo)原酶的配(pèi)製：常用(yòng)的是(shì)DMEM進(jìn)行(háng)配製，配製(zhì)好(hǎo)的膠原酶消(xiāo)化液(yè)放(fàng)置在37℃水浴鍋內預(yù)熱(rè)（注意(yì)現用(yòng)現配）。

膠原(yuán)酶消化時間：根(gēn)據(jù)組(zǔ)織(zhī)特性，消化(huà)時間會有(yǒu)差異(yì)。以(yǐ)小鼠腎細胞(bāo)為(wéi)例(lì)，加(jiā)入膠(jiāo)原(yuán)酶(méi)Ⅰ進行(háng)消(xiāo)化後，放(fàng)入37℃培養箱中消化(huà)45min~1h左(zuǒ)右(yòu)，期間(jiān)每隔(gé)10min中(zhōng)震蕩(dàng)一次(cì)，知道組織(zhī)塊幾(jī)乎(hū)wan全消(xiāo)失(shī)為止（若(ruò)是組(zǔ)織(zhī)塊(kuài)剪得非常細小，時(shí)間可以(yǐ)短一些，30min左右即可(kě)）。

培(péi)養(yǎng)過程(chéng)：注意原代細胞(bāo)在(zài)培養2天(tiān)後可(kě)能(néng)會(huì)出(chū)現(xiàn)細胞液(yè)變黃（橘黃色）的現象(xiàng)，且(qiě)無漂浮(fú)物，這是(shì)正常(cháng)現象(xiàng)哦，不(bù)是汙染(rǎn)。這是(shì)由於細胞在(zài)貼(tiē)壁(bì)生長過(guò)程中釋(shì)放(fàng)了CO2和(hé)其他(tā)物質導(dǎo)致培(péi)養(yǎng)液(yè)PH發(fā)生了改變(biàn)，所(suǒ)以變黃。

2. 組(zǔ)織塊法

取(qǔ)材：取組織中間(jiān)部(bù)位(wèi)，剪成(chéng)大小均匀的(dí)小方塊(kuài)（1~4mm²），清洗(xǐ)幹(gān)淨(jìng)後轉移至培(péi)養(yǎng)皿中，在(zài)培(péi)養皿(mǐn)中各(gè)組織(zhī)塊(kuài)要排列均匀。 

加液：培養液(yè)不(bù)能浸沒(méi)組織(zhī)塊(kuài)，避免組(zǔ)織漂(piāo)浮。然(rán)後培養4h左右加培養液(yè)，培養(yǎng)48h後換(huàn)液(yè)。

二(èr)，培(péi)養時間

無(wú)論是(shì)酶(méi)消(xiāo)化法還(huán)是組(zǔ)織(zhī)塊法，取樣後(hòu)培養時間最少需要一周以上(shàng)的時(shí)間，期間(jiān)可換液或者傳(chuán)代(dài)。

三(sān)，換液(yè)時間(jiān)

無(wú)論(lùn)酶消(xiāo)化法(fǎ)還是組(zǔ)織塊(kuài)法，在培養期間需(xū)要隨時關(guān)注細胞(bāo)的(dí)生(shēng)長狀況，需(xū)觀(guān)察其是(shì)否貼(tiē)壁，是否汙(wū)染(rǎn)，組織(zhī)塊法要觀察是否(fǒu)有細胞(bāo)遷(qiān)移(yí)出(chū)來。正(zhèng)常(cháng)情況(kuàng)下(xià)48~72h可(kě)換液一次(cì)。

四，細胞(bāo)狀(zhuàng)態判(pàn)斷

正常貼壁(bì)細胞在(zài)培(péi)養幾(jī)天後(hòu)，會逐漸(jiàn)貼(tiē)滿整個瓶底(dǐ)或者皿(mǐn)底(dǐ)，有的(dí)呈纖維(wéi)狀，有的呈多邊(biān)形。這些細胞的狀(zhuàng)態比較好，生(shēng)長(cháng)至(zhì)80%~90%融(róng)合就可(kě)以傳代(dài)啦(lā)，傳(chuán)代一(yī)次後的(dí)細(xì)胞(bāo)會更幹(gān)淨漂亮(liàng)。

五，凍存(cún)

傳一代後的(dí)細胞(bāo)（也(yě)可(kě)以不傳代(dài)直接凍存）培(péi)養至(zhì)80%~90%便(biàn)可凍(dòng)存(cún)起來供(gōng)後續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍(dòng)存液配製：不(bù)同(tóng)的細胞(bāo)可能(néng)會有不(bù)同(tóng)的凍(dòng)存液(yè)配製方案(àn)，各實(shí)驗室(shì)也有自己(jǐ)的(dí)凍存方(fāng)案(àn)，

常見(jiàn)的方(fāng)案(àn)有(yǒu)：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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