熒光定量PCR（Real-time PCR），是(shì)指在PCR擴增反應體(tǐ)係中加(jiā)入熒光基團，通(tōng)過(guò)對擴增反(fǎn)應(yīng)中(zhōng)每一個(gè)循環產物(wù)熒光(guāng)信(xìn)號的實時(shí)檢(jiǎn)測,最後(hòu)通(tōng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)對(duì)未知(zhī)模板進行定(dìng)量分析的方(fāng)法
。那麼你(nǐ)知道熒(yíng)光定量(liáng)PCR的(dí)原(yuán)理是(shì)什麼(mó)嗎(má)
？讓(ràng)我(wǒ)們(mén)一(yī)起(qǐ)來看(kàn)看吧！

以(yǐ)探針法(fǎ)熒(yíng)光(guāng)定量(liáng)PCR為例：PCR擴增時在加入(rù)一(yī)對引物(wù)的(dí)同(tóng)時(shí)加入一(yī)個(gè)特異(yì)性的(dí)熒光(guāng)探針(zhēn)，該探針兩(liǎng)端(duān)分別(bié)標記(jì)一(yī)個報告熒光基(jī)團(tuán)和一(yī)個淬滅熒光(guāng)基團
。開始時(shí)，探(tàn)針完整地(dì)結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報(bào)告基(jī)團發射的熒(yíng)光信號被淬滅基團吸收(shōu)，檢測(cè)不(bù)到(dào)熒(yíng)光信號；PCR擴增(zēng)時(shí)，Taq酶將(jiāng)探針酶切(qiē)降(jiàng)解(jiě)，使報告(gào)熒光(guāng)基團和(hé)淬滅(miè)熒光基團分(fēn)離(lí)，從(cóng)而熒(yíng)光監測係(xì)統可(kě)接收(shōu)到熒光信號(hào)，即(jí)每(měi)擴增一(yī)條DNA鏈(liàn)，就(jiù)有(yǒu)一個(gè)熒光分子(zǐ)形成，實(shí)現了(liǎo)熒(yíng)光(guāng)信號(hào)的(dí)累(léi)積與PCR產物(wù)形(xíng)成完quan同步
。

傳統的PCR進行檢測時，擴(kuò)增反應後需要(yào)進行染色處理及電(diàn)泳分離，並且隻能(néng)作定(dìng)性分(fēn)析(xī)，不能(néng)準確定量，易(yì)造成(chéng)汙(wū)染(rǎn)出(chū)現(xiàn)假陽(yáng)性，使其(qí)應(yīng)用受到限(xiàn)製
。實(shí)時(shí)定(dìng)量PCR技(jì)術不僅(jǐn)實(shí)現了對(duì)模板(bǎn)的定(dìng)量，且(qiě)具有靈(líng)敏度(dù)高，特異(yì)性(xìng)和(hé)可靠(kào)性更好(hǎo)，自動化(huà)程度(dù)高和(hé)無汙染的特(tè)點(diǎn)，使得(dé)熒光定(dìng)量PCR逐漸取(qǔ)代(dài)常規(guī)PCR
。

在PCR擴增(zēng)反(fǎn)應的(dí)最初數(shù)個(gè)循環裏，熒光信號變(biàn)化(huà)不(bù)大，接(jiē)近(jìn)一條直綫，這樣的直綫(xiàn)即是基(jī)綫，這條綫(xiàn)是可以自動生(shēng)成也可以手動設置的
。之後反應會(huì)進(jìn)入(rù)指數增(zēng)長(cháng)期，這(zhè)個期間擴(kuò)增曲(qū)綫(xiàn)具(jù)有(yǒu)高(gāo)度重復性，在(zài)該期間(jiān)，可(kě)設定(dìng)一(yī)條(tiáo)熒(yíng)光閾值綫，它可以(yǐ)設定在熒光(guāng)信號(hào)指數擴增(zēng)階段任(rèn)意位(wèi)置上(shàng)，但一般會將熒光(guāng)閾值(zhí)的(dí)缺省(shěng)設(shè)置是(shì) 3-15 個循環(huán)的(dí)熒(yíng)光信(xìn)號(hào)的標準(zhǔn)偏差的(dí)10 倍
。每個(gè)反(fǎn)應管內的(dí)熒(yíng)光(guāng)信號(hào)到達(dá)設(shè)定(dìng)的(dí)閾值(zhí)時(shí)所(suǒ)經歷(lì)的循(xún)環數被稱(chēng)為CT值，這個值與起始濃度的對數成(chéng)綫性(xìng)關係，且該值具有重(zhòng)現性(xìng)
。

Ct值最大(dà)的(dí)意(yì)義就是(shì)用來(lái)計(jì)算目(mù)的(dí)基(jī)因的表(biǎo)達(dá)量，此(cǐ)時(shí)就有兩(liǎng)個概(gài)念容易被(bèi)提及(jí)，那(nà)就是(shì)絕對(duì)定量(liáng)和相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)，絕對定量的目的是(shì)測定(dìng)目的基因(yīn)在(zài)樣本中(zhōng)的分子(zǐ)數(shù)目(mù)，即通常所(suǒ)說(shuō)的拷(kǎo)貝數
。相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)的目(mù)的是測(cè)定目的基因(yīn)在兩(liǎng)個(gè)或多個樣本中的含(hán)量的相對比(bǐ)例(lì)，而(ér)不(bù)需(xū)要知(zhī)道它們在每個樣本中(zhōng)的(dí)拷貝(bèi)數
。

Ct值誠然可以被利用來(lái)計(jì)算(suàn)這兩(liǎng)種定(dìng)量(liáng)結果(guǒ)，但是絕對定量(liáng)實(shí)驗必(bì)須使用已(yǐ)知拷(kǎo)貝數(shù)的(dí)絕對標準品(pǐn)，必須(xū)做(zuò)標(biāo)準曲綫
。相(xiāng)對定量可(kě)以做(zuò)標準曲綫，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)
。絕對標(biāo)準品製(zhì)作困難(nán)難以獲取(qǔ)，實(shí)驗(yàn)室基本(běn)都是選擇相對(duì)定量(liáng)的方法來計(jì)算(suàn)相(xiāng)對基因表達量
。

更(gēng)多有(yǒu)關(guān)熒(yíng)光定量PCR原(yuán)理問題，請聯係天津益(yì)元利(lì)康生(shēng)物科(kē)技有限(xiàn)公(gōng)司(sī)：