熒(yíng)光(guāng)原(yuán)位(wèi)雜交是一門新(xīn)興的分(fēn)子(zǐ)細胞遺傳學(xué)技(jì)術(shù)，目前這(zhè)項技(jì)術已經廣泛(fàn)應(yīng)用(yòng)於動(dòng)植物基因組(zǔ)結構研(yán)究(jiū)，染色體(tǐ)精(jīng)細結構(gòu)變異(yì)分(fēn)析(xī)，病毒(dú)感染(rǎn)分(fēn)析(xī)，人類(lèi)產(chǎn)前診斷，腫瘤遺傳學(xué)和(hé)基因(yīn)組進化(huà)研究(jiū)待許(xǔ)多(duō)領域。那(nà)麼你(nǐ)知道熒光(guāng)原(yuán)位(wèi)雜交實驗(yàn)的方(fāng)法與步驟(zhòu)是什麼(mó)嗎？讓(ràng)我(wǒ)們一(yī)起(qǐ)來看看吧(bā)！

一(yī)，探(tàn)針變性

將探針在 75℃恒(héng)溫水(shuǐ)浴中(zhōng)溫(wēn)育 5 min，立(lì)即置 0℃，5～10 min，使雙鏈 DNA 探(tàn)針變(biàn)性。

二，標本變性

（1）將製備好的染色(sè)體(tǐ)玻片(piàn)標本(běn)於 50℃培養(yǎng)箱中烤(kǎo)片(piàn) 2～3 h。（經(jīng) Giemsa 染色的(dí)標(biāo)本(běn)需預(yù)先(xiān)在固定(dìng)液中退色後再(zài)烤片）。

（2）取出(chū)玻(bō)片標本(běn)，將(jiāng)其浸(jìn)在 70～75℃的體積分(fēn)數 70% 甲(jiǎ)酰胺(àn)/2×SSC 的變性液(yè)中(zhōng)變(biàn)性(xìng)2～3 min。

（3）立即按順序(xù)將(jiāng)標(biāo)本(běn)經體積分數 70%，體積分數 90%和體積(jī)分(fēn)數(shù) 100%冰(bīng)乙醇(chún)係列(liè)脫(tuō)水，每次(cì) 5 min，然後空(kōng)氣幹燥。

三，雜交(jiāo)

將已(yǐ)變(biàn)性或預退(tuì)火的(dí) DNA 探針 10 μL 滴於已變性並脫(tuō)水(shuǐ)的玻(bō)片標本(běn)上，蓋(gài)上 18×18 蓋玻片(piàn)，用(yòng) Parafilm 封片(piàn)，置於潮濕暗盒中 37℃雜交過(guò)夜（約(yuē) 15～17 h）。由於雜(zá)交液(yè)較少(shǎo)，而且雜交溫度較(jiào)高(gāo)，持(chí)續時(shí)間又長，因(yīn)此為(wéi)了(liǎo)保持(chí)標本(běn)的(dí)濕潤(rùn)狀態，此過程在濕(shī)盒(hé)中進行。

四(sì)，洗脫(tuō)

此步驟(zhòu)有(yǒu)助於除(chú)去(qù)非特異(yì)性結(jié)合(hé)的(dí)探針，從(cóng)而降(jiàng)低(dī)本(běn)底。

（1）雜交次(cì)日，將標本(běn)從 37℃溫箱(xiāng)中(zhōng)取出(chū)，用刀片輕輕(qīng)將蓋(gài)玻片(piàn)揭掉。

（2）將(jiāng)已雜(zá)交的玻片標本(běn)放(fàng)置(zhì)於已預熱(rè) 42～50℃的體(tǐ)積(jī)分數(shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌(dí)3 次(cì)，每次(cì) 5 min。

（3）在已(yǐ)預(yù)熱 42～50℃的(dí) 1×SSC 中(zhōng)洗(xǐ)滌(dí) 3 次(cì)，每(měi)次 5 min。

（4）在(zài)室溫(wēn)下(xià)，將玻(bō)片(piàn)標本於 2×SSC 中(zhōng)輕洗一下(xià)。

（5）取(qǔ)出(chū)玻片，自(zì)然幹燥。

（6）取(qǔ) 200 μL 復(fù)染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴(dī)加(jiā)在玻片(piàn)標本上(shàng)，蓋上蓋玻(bō)片。

五，雜(zá)交(jiāo)信號的(dí)放大（適(shì)用於(yú)使用生物(wù)素標記的探針）

（1）在(zài)玻(bō)片的(dí)雜(zá)交(jiāo)部位加 150 μL 封(fēng)閉(bì)液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育(yù) 20min。

（2）去掉(diào)保(bǎo)鮮(xiān)膜(mó)，再(zài)加 150 μL avidin-FITC 於標(biāo)本(běn)上，用(yòng)保鮮膜(mó)覆(fù)蓋(gài)，37℃繼續溫(wēn)育(yù) 40 min。

（3）取出標本，將其(qí)放入已預熱 42～50℃的洗脫液中洗(xǐ)滌(dí) 3 次(cì)，每次 5 min。

（4）在玻片標本的雜交部(bù)位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保(bǎo)鮮(xiān)膜，37℃溫(wēn)育 20 min。

（5）去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 於標本上(shàng)，覆蓋新(xīn)的保鮮(xiān)膜(mó)，37℃溫育(yù) 40 min。

（6）取出(chū)標(biāo)本(běn)，將(jiāng)其(qí)放入(rù)已(yǐ)預(yù)熱(rè) 42～50℃的新洗(xǐ)脫液中，洗滌(dí) 3 次，每(měi)次 5 min。

（7）重復(fù)步(bù)驟（1），（2），（3），再於 2×SSC 中室溫(wēn)清(qīng)洗一下。

（8）取出玻(bō)片(piàn)，自然(rán)幹燥。

（9）取 200 μL PI/antifade 染(rǎn)液(yè)滴加(jiā)在玻片標(biāo)本上，蓋(gài)上(shàng)蓋玻片。

六(liù)，封(fēng)片(piàn)

可采(cǎi)用(yòng)不同(tóng)類型的(dí)封(fēng)片液。如果(guǒ)封片液(yè)中(zhōng)不含(hán)有 Mowiol（可(kě)使封(fēng)片液產(chǎn)生(shēng)自封閉作(zuò)用(yòng)），為防止(zhǐ)蓋片與(yǔ)載片(piàn)之(zhī)間的溶液(yè)揮發，可使(shǐ)用指甲油將蓋(gài)片周(zhōu)圍(wéi)封(fēng)閉。封好的(dí)玻片(piàn)標本可以在(zài)-20～-70℃的冰(bīng)箱中(zhōng)的(dí)暗盒(hé)中保持(chí)數月之(zhī)久。

七(qī)，熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果(guǒ)

先(xiān)在可(kě)見光(guāng)源下(xià)找(zhǎo)到具有(yǒu)細胞分裂(liè)相的(dí)視野，然後打開熒光(guāng)激發光源，FITC 的激發波(bō)長為(wéi)490 nm。細胞(bāo)被 PI 染成(chéng)紅色，而經 FITC 標記的(dí)探針所(suǒ)在(zài)的(dí)位置(zhì)發(fā)出綠色(sè)熒光。

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