免疫熒光是(shì)一種常用的(dí)光學(xué)顯(xiǎn)微術，即用熒(yíng)光(guāng)顯微鏡(jìng)來(lái)觀(guān)察細(xì)胞(bāo)中(zhōng)的(dí)特定(dìng)生物(wù)分子(zǐ)。免(miǎn)疫熒(yíng)光依賴(lài)於(yú)抗(kàng)體抗原的特異(yì)性結(jié)合(hé)，然後通過直(zhí)接(jiē)標記或(huò)間接(jiē)標(biāo)記方(fāng)法使用熒光分子指征抗(kàng)體-抗原結合的位(wèi)置，以確(què)定目標(biāo)生物分子在(zài)細胞中的(dí)位(wèi)置(zhì)，豐度(dù)和分布(bù)情況。那(nà)麼(mó)你知道免疫(yì)熒(yíng)光實驗(yàn)流(liú)程有哪(nǎ)些嗎(má)？讓(ràng)我(wǒ)們一起(qǐ)來(lái)看(kàn)看吧！

1. 固(gù)定

固定(dìng)液種類(lèi)：有機(jī)溶(róng)劑(jì)（甲醇，乙(yǐ)醇，丙(bǐng)酮等(děng)）；交聯(lián)劑(jì)（4%PFA，10%中性福(fú)爾馬林(lín)），固定液的(dí)選(xuǎn)擇(zé)取(qǔ)決於被研究(jiū)抗(kàng)原的性質及所(suǒ)用(yòng)抗(kàng)體(tǐ)的(dí)特性。但(dàn)針對(duì)磷酸化(huà)的抗(kàng)體(tǐ)，不(bù)適合用(yòng)甲(jiǎ)醛，會(huì)導(dǎo)致(zhì)磷酸(suān)蛋白(bái)從(cóng)膜表麵(miàn)轉(zhuǎn)移到(dào)胞漿(jiāng)中，故(gù)應(yīng)選(xuǎn)擇冰冷(lěng)的無水甲醇或無水乙(yǐ)醇(chún)，同時(shí)應注意(yì)甲醛(quán)會(huì)揮發，在(zài)4-8°C不宜(yí)儲存太(tài)久(jiǔ)。

固定時間：取決(jué)於(yú)組(zǔ)合(hé)塊(kuài)的大小和類型(xíng)，對於大(dà)多數(shù)組織，18-24h較為(wéi)理想，細(xì)胞(bāo)固定時間較短(duǎn)，一般2%的(dí)甲醛室溫固定(dìng)20min即(jí)可。

2. 透(tòu)化

通(tōng)透(tòu)的目的(dí)是(shì)使抗(kàng)體進入(rù)胞內(nèi)。0.5% Triton X-100 室溫(wēn)通(tōng)透20 min（針對胞內抗原(yuán)，若是細胞膜上表(biǎo)達的抗原(yuán)則省略該(gāi)步驟(zhòu)）；除了Triton X-100，丙酮也可作為通透劑，並(bìng)且丙(bǐng)酮固定後的(dí)樣(yàng)品(pǐn)不(bù)需要(yào)通(tōng)透。

3. 封(fēng)閉(bì)

封(fēng)閉可減(jiǎn)少一抗和二(èr)抗(kàng)與非特異性(xìng)位(wèi)點結合(hé)。通(tōng)透(tòu)後用(yòng)PBS浸洗(xǐ)玻片3次(cì)，每(měi)次(cì)3 min，吸水紙吸(xī)幹(gān)PBS，在(zài)玻片(piàn)上滴(dī)加(jiā)山羊血(xiě)清，室溫封閉30min。常(cháng)用(yòng)的(dí)封閉(bì)液包(bāo)括：與二(èr)抗同一(yī)來(lái)源的(dí)血清(qīng)，BSA或者是羊(yáng)血清。從封(fēng)閉開始所(suǒ)有的(dí)步驟(zhòu)，一(yī)定要(yào)注(zhù)意(yì)樣品(pǐn)的(dí)保濕(shī)，避(bì)免樣(yàng)品的(dí)幹(gān)燥，否(fǒu)則極(jí)易(yì)產生較(jiào)高(gāo)的(dí)背景。醛類固(gù)定的(dí)樣品(pǐn)，在(zài)用一抗孵育前用含0.3M甘氨(ān)酸(suān)的封閉(bì)液進(jìn)行(háng)封閉(bì)。

4. 一抗孵育

根據一抗說(shuō)明(míng)書(shū)，按(àn)照(zhào)適當(dāng)比(bǐ)例用一抗稀釋(shì)液稀(xī)釋一抗(kàng)，用(yòng)吸水紙(zhǐ)吸(xī)盡(jìn)封閉液(yè)，每(měi)張玻片(piàn)滴加稀(xī)釋(shì)好的(dí)一抗並放入濕(shī)盒， 4℃孵(fū)育過夜。回收一抗，加(jiā)入PBST， 在(zài)搖床上緩慢搖動洗滌5 min，共(gòng)洗滌3次。

5. 熒光二抗(kàng)孵育

用(yòng)吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)吸盡(jìn)洗(xǐ)滌液(yè)後滴加(jiā)稀釋好的(dí)熒(yíng)光二(èr)抗，濕盒中(zhōng)孵育(yù)1h後，回收(shōu)二(èr)抗，接(jiē)著(zhuó)用PBST洗3次(cì)，每次5 min；由於熒(yíng)光容(róng)易(yì)淬(cuì)滅，故從加(jiā)熒光二抗起，後麵所(suǒ)有(yǒu)操(cāo)作(zuò)步驟都(dū)要(yào)避光(guāng)。

6. 復(fù)染核(hé)（定位的關鍵）

在玻片上滴加DAPI，並(bìng)注意避光孵育5min，對(duì)標本(běn)進行染(rǎn)核，然(rán)後(hòu)用PBST洗(xǐ)3次(cì)，每次5min，洗(xǐ)去(qù)多(duō)餘(yú)的DAPI。

7. 封片

用吸(xī)水(shuǐ)紙吸幹爬(pá)片上的液(yè)體(tǐ)，用(yòng)含(hán)抗熒光(guāng)淬滅(miè)劑的封片(piàn)液封(fēng)片，然(rán)後在(zài)熒(yíng)光顯(xiǎn)微(wēi)鏡下觀(guān)察(chá)。

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