巨噬細(xì)胞(bāo)是機體免疫係統(tǒng)的重要細(xì)胞成(chéng)分(fēn)，具有抗感染
，抗腫(zhǒng)瘤和參與免疫應(yīng)答
，免(miǎn)疫(yì)調(tiáo)節等生(shēng)物學功(gōng)能
。腹腔巨噬(shì)細(xì)胞多遊離(lí)存在於腹水中易於獲(huò)得
。因此，可以(yǐ)通過(guò)向小(xiǎo)鼠(shǔ)腹(fù)腔內(nèi)注(zhù)射(shè)刺(cì)激物(wù)製(zhì)造無菌(jūn)炎症環境(jìng)以積(jī)聚巨(jù)噬細胞，來進行(háng)巨(jù)噬細胞研究
。那(nà)麼(mó)巨噬(shì)細胞(bāo)的(dí)提取和分離(lí)方法是(shì)什麼(mó)呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一
，材料

小(xiǎo)鼠，SPF級(jí)，體質量18～22 g，雄(xióng)性，6～8周齡(líng)
。

二(èr)
，肉(ròu)湯製備(bèi)

1. 6%澱(diàn)粉肉湯製備

將(jiāng)1.0g胰蛋(dàn)白(bái)腖
，0.3g牛肉(ròu)浸(jìn)膏(gāo)和0.5g氯(lǜ)化(huà)鈉(nà)放入盛有100 mL雙蒸(zhēng)水的(dí)燒杯中，置於磁力攪(jiǎo)拌器常(cháng)溫溶(róng)解後(hòu)121℃滅菌30min，於4℃保存(cún)
。

2. 3%巰基乙酸(suān)鹽肉(ròu)湯的(dí)製(zhì)備(bèi)

1L雙蒸水(shuǐ)中(zhōng)加入29g巰(qiú)基乙酸鹽，煮(zhǔ)沸使(shǐ)其wan全(quán)溶(róng)解，玻璃(lí)瓶或離心管(guǎn)分裝(zhuāng)後121℃滅菌15min，4℃保存，使(shǐ)用前確保已(yǐ)經(jīng)冷卻(què)
。

三(sān)
，巨噬(shì)細胞(bāo)的誘導

每次腹(fù)腔注(zhù)射(shè)3%巰基乙(yǐ)酸(suān)鹽(yán)肉湯(tāng)1mL，每天1次(cì)，3d後用預冷PBS灌洗腹腔2次(cì)
。

四
，巨噬細胞的收(shōu)集

準備75%乙醇，以脫頸(jǐng)方式(shì)處(chǔ)死小鼠(shǔ)，浸(jìn)泡(pào)3min
。取(qǔ)出，置於(yú)無(wú)菌(jūn)操作(zuò)台，仰臥(wò)位(wèi)固(gù)定小(xiǎo)鼠，右手(shǒu)持(chí)注射器於(yú)右下腹部(bù)將針頭(tóu)刺(cì)入皮下進入(rù)腹腔(qiāng)，將5mL預(yù)冷的PBS(培養液(yè)組(zǔ)為(wéi)5mL預(yù)冷的10%血清RPMI 1640培養液) 注(zhù)入(rù)腹(fù)腔，按摩小鼠(shǔ)腹部5min
。無菌條件下剪(jiǎn)開(kāi)小(xiǎo)鼠腹(fù)部皮膚(fū)顯(xiǎn)露(lòu)胸腹(fù)部(bù)，用無(wú)菌(jūn)止(zhǐ)血(xiě)鉗提(tí)起(qǐ)劍(jiàn)突處組織，無(wú)菌剪刀(dāo)在(zài)該處剪開約1mm2小(xiǎo)口(kǒu)
。注意止血鉗保持提(tí)起狀(zhuàng)態，用無(wú)菌巴(bā)氏吸(xī)管從腹腔開口(kǒu)深入腹腔，反復衝洗(xǐ)腹(fù)膜(mó)腔灌洗(xǐ)液(yè)2次(cì)，可(kě)回收(shōu)約(yuē)8mL 淡黃色(sè)灌洗(xǐ)液
。

五(wǔ)
，巨噬細胞的(dí)純化與(yǔ)培養(yǎng)

將每隻小(xiǎo)鼠的(dí)灌洗液於常溫(wēn)條(tiáo)件下(xià)1000r /min 離心10min，所(suǒ)得細胞(bāo)沉(chén)澱用(yòng)ＲPMI 1640培養(yǎng)液(yè)重(zhòng)懸(xuán)接(jiē)種，培養(yǎng)體(tǐ)係(xì)於(yú)37℃靜置培養(yǎng)2～3h後(hòu)洗(xǐ)去(qù)未(wèi)貼壁(bì)細(xì)胞(bāo)，餘下的貼(tiē)壁細胞(bāo)即為巨噬細(xì)胞(bāo)

六
，巨(jù)噬細胞形態學觀察(chá)及(jí)計數

細(xì)胞(bāo)貼(tiē)壁培養(yǎng)24h後在(zài)倒(dǎo)置(zhì)顯微(wēi)鏡下觀察(chá)各組(zǔ)細(xì)胞(bāo)形(xíng)態
。用(yòng)0.5%胰酶(méi)消化(huà)細胞，離心棄上清液，PBS重懸(xuán)得到(dào)細胞懸(xuán)液，用(yòng)細胞(bāo)計數(shù)板計數每隻小鼠腹腔(qiāng)中(zhōng)分(fēn)離的(dí)巨噬(shì)細(xì)胞(bāo)數量
。

七
，台盼藍染(rǎn)色檢(jiǎn)測巨(jù)噬(shì)細胞(bāo)活性

將(jiāng)500μL的各組巨噬(shì)細胞懸(xuán)液和(hé)500μL台盼藍(lán)染液(yè)(0.4%濃(nóng)度(dù)) 加(jiā)入3.5cm培(péi)養皿(mǐn)，搖匀後(hòu)靜(jìng)置3～8min; 吸(xī)取1滴混合(hé)液滴(dī)入(rù)載(zǎi)玻(bō)片(piàn)，3min內(nèi)鏡(jìng)下計(jì)數巨噬細(xì)胞200個(gè)，分(fēn)別統計(jì)活/死細(xì)胞(bāo)數(shù)目(mù)(死細胞呈(chéng)藍色(sè)，活細胞無(wú)色(sè)透(tòu)亮) ; 細(xì)胞活(huó)性(xìng)(%) = 活細(xì)胞數(shù)/200×100%
。每組檢測重(zhòng)復(fù)3次(cì)
。

更(gēng)多有(yǒu)關巨噬細(xì)胞的提(tí)取和(hé)分離方法，請(qǐng)聯(lián)係天(tiān)津(jīn)益(yì)元利康(kāng)生(shēng)物科技(jì)有限(xiàn)公司(sī)：