你知道(dào)PCR技術的基本原理
，各(gè)步(bù)驟的(dí)目(mù)的是(shì)什麼嗎(má)？讓(ràng)我們(mén)一起(qǐ)來(lái)看看吧(bā)！

一(yī)
，PCR技(jì)術基本原理

PCR是(shì)一(yī)種選擇性體外(wài)快速(sù)擴增DNA片段的方法。在體外(wài)以類(lèi)似(sì)於細胞內DNA的半保(bǎo)留(liú)復製(zhì)過(guò)程(chéng)
，以擬擴(kuò)增(zēng)的(dí)模(mó)板(bǎn)DNA分(fēn)子
，與模(mó)板(bǎn)DNA互(hù)補的(dí)寡核(hé)苷酸(suān)引(yǐn)物
，DNA聚合(hé)酶
，4種dNTP及(jí)適合的緩衝體係組成(chéng)的反應體(tǐ)係
，經過(guò)重(zhòng)復地變(biàn)性(xìng)一退火一延(yán)伸(shēn)三(sān)步(bù)
，擴增(zēng)新的(dí)目(mù)的DNA鏈
，這個過程(chéng)通過控製反(fǎn)應(yīng)體係的溫度(dù)來實現(xiàn)。

PCR包含下(xià)列三步反應(yīng)
：

1
，變(biàn)性(denaturation)

將反應體係混合物經加熱至(zhì)94℃左右
，維持(chí)較短的時(shí)間(jiān)
，使(shǐ)雙(shuāng)鏈(liàn)DNA變(biàn)成單(dān)鏈(liàn)DNA
，便於下一步引物(wù)的結合。

2
，退(tuì)火(annealing)

將(jiāng)反應體係溫度下(xià)降到特(tè)定溫(wēn)度（一(yī)般是(shì)引(yǐn)物的(dí)Tm值以下(xià))
，引物與(yǔ)DNA模板(bǎn)以鹼基(jī)互(hù)補(bǔ)的(dí)方式(shì)結(jié)合(hé)
，形成(chéng)模板-引物雜交(jiāo)雙鏈(liàn)。退(tuì)火溫度是(shì)保(bǎo)證引物與(yǔ)DNA模(mó)板(bǎn)互補(bǔ)結(jié)合的(dí)關鍵。由於(yú)引物結構(gòu)簡單(dān)
，加之(zhī)引物(wù)量遠遠(yuǎn)大(dà)於模板DNA的數(shù)量
，所以(yǐ)DNA模板(bǎn)單鏈之間(jiān)的互(hù)補結(jié)合很少。

3
，延伸(elongation)

將(jiāng)反應(yīng)體係(xì)的溫度上升到(dào)72℃左(zuǒ)右並維(wéi)持一(yī)段時(shí)間
，在(zài)Taq DNA聚(jù)合酶(méi)的作用下
，以(yǐ)引物為起始點(diǎn)
，以4種單(dān)核苷酸(suān)（dNTP）為(wéi)底(dǐ)物
，從5'→3'方向延(yán)伸反(fǎn)應
，合成(chéng)新的(dí)DNA雙(shuāng)鏈。

以(yǐ)上三(sān)步反應(yīng)為一個(gè)循環
，重復進(jìn)行變性(xìng)
，退火
，延伸(shēn)這三(sān)步(bù)反(fǎn)應(yīng)
，如(rú)此(cǐ)反復循環(huán)可以使DNA以指(zhǐ)數形式進行(háng)擴(kuò)增(zēng)。上(shàng)述過程1.5小時左右(yòu)完成(chéng)
，從(cóng)而(ér)使所需的(dí)目的DNA片段(duàn)擴增(zēng)放大百萬(wàn)倍(bèi)。

二
，PCR各步(bù)驟目的(dí)

1
，預(yù)變性

破壞DNA中(zhōng)可能存在較(jiào)難破壞的二級結構。使DNA充分(fēn)變性
，減(jiǎn)少DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴增(zēng)的影響(xiǎng)
，以利於引(yǐn)物(wù)更好地和模(mó)板結合
，特別是對(duì)於基(jī)因組來(lái)源的DNA模板
，最(zuì)好(hǎo)不要省(shěng)去這個步驟。此(cǐ)外
，在(zài)一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應中
，還(huán)可激(jī)活Taq酶(méi)
，從而使PCR反應(yīng)得(dé)以(yǐ)順利進行(háng)。

2
，變(biàn)性(xìng)一退(tuì)火(huǒ)一延(yán)伸(shēn)循環

(1)模(mó)板DNA的(dí)變性

模(mó)板DNA經(jīng)加熱至93℃左(zuǒ)右一定時間(jiān)後(hòu)
，使模板(bǎn)DNA雙鏈或(huò)經PCR擴增(zēng)形成(chéng)的(dí)雙徒(tú)DNA解離
，使(shǐ)之(zhī)成(chéng)為(wéi)單鏈
，以便(biàn)它(tā)與(yǔ)引物結合
，為(wéi)下輪反應(yīng)做準備(bèi)。

(2)模板DNA與(yǔ)引物的(dí)退火（復(fù)性）

模板DNA經加熱變性成單鏈後
，溫度降至55℃左(zuǒ)右
，引(yǐn)物與(yǔ)模(mó)板DNA單(dān)鏈(liàn)的(dí)互(hù)補序(xù)列配對結合。

(3)引物的延(yán)伸(shēn)

DNA模板—引物結合(hé)物(wù)在TaqDNA聚合酶的(dí)作(zuò)用下(xià)
，以dNTP為(wéi)反(fǎn)應原(yuán)料
，靶序列為(wéi)模(mó)板
，按鹼(jiǎn)基配對(duì)與(yǔ)半(bàn)保留(liú)復製(zhì)原理
，合成一條新(xīn)的與(yǔ)模(mó)板DNA鏈互補(bǔ)的(dí)半保(bǎo)留復製鏈(liàn)。

3
，PCR儀擴增循(xún)環(huán)後72℃延伸10分(fēn)鐘

用PCR儀擴增時(shí)
，變性一(yī)退火一延(yán)伸循(xún)環完(wán)成後
，繼續(xù)72℃延伸(shēn)10分鐘(zhōng)的原因是
：

(1)在反(fǎn)應體(tǐ)係一(yī)定的條(tiáo)件(jiàn)下(xià)
，延伸時(shí)間取決(jué)於(yú)待(dài)擴(kuò)增DNA片段的長度。例如(rú)
，使(shǐ)用Taq DNA聚合(hé)酶(méi)
，72℃時的鹼基摻入率(shuài)為(wéi)35~100bp/s
，因此延伸速(sù)率為(wéi)1kb/min。

(2)根據(jù)延伸速率推得(dé)
，擴(kuò)增(zēng)1kb以內的DNA片段1分鐘(zhōng)即可(kě)
，而3~4kb則(zé)需要(yào)3~4分(fēn)鐘
，依次類推。通常(cháng)
，在最(zuì)後一輪要適當(dāng)地(dì)將(jiāng)延(yán)伸(shēn)時間(jiān)延(yán)長(cháng)至(zhì)4~10分(fēn)鐘
，這樣(yàng)做是(shì)使PCR反(fǎn)應wan全(quán)以提高擴增產(chǎn)量。

(3)繼續72℃延伸10分(fēn)鐘除了可以(yǐ)使PCR反(fǎn)應(yīng)wan全以提(tí)高擴(kuò)增產量外(wài)
，還(huán)有一(yī)個(gè)作(zuò)用是
：在用(yòng)普通(tōng)Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時在產(chǎn)物(wù)末端加A尾(wěi)的作用
，可以直接(jiē)用於TA克(kè)隆(lóng)的進行(háng)。

更多有(yǒu)關PCR的(dí)基本(běn)原理與各(gè)步(bù)驟(zhòu)的目的(dí)
，請(qǐng)聯係天津益元(yuán)利康(kāng)生物(wù)科(kē)技有限(xiàn)公司(sī)
：