你知道PCR反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)主(zhǔ)要包含(hán)那些(xiē)嗎(má)？讓我們一(yī)起(qǐ)來(lái)看(kàn)看(kàn)吧(bā)！

一(yī)，模板(bǎn)（template)

模板即(jí)擴增用(yòng)的DNA，可以是任(rèn)何來源(yuán)DNA(如基(jī)因組DNA，質(zhì)粒(lì)DNA等)或(huò)RNA（如(rú)總RNA，mRNA，tRNA，rRNA，病毒(dú)RNA等(děng)），但(dàn)必(bì)須(xū)符合兩(liǎng)個條(tiáo)件(jiàn)：一(yī)是純(chún)度(dù)必(bì)須較高(gāo)，二是(shì)濃(nóng)度不能(néng)太高(gāo)以(yǐ)免抑(yì)製(zhì)。模板(bǎn)是待擴增的目(mù)的(dí)基(jī)因或(huò)特(tè)異片(piàn)段，如(rú)診斷病人是否攜帶(dài)有(yǒu)突變基(jī)因(yīn)時，其模板(bǎn)就是(shì)提取的(dí)病人血液(yè)中(zhōng)的(dí)DNA或(huò)RNA片段。PCR對(duì)模板DNA的(dí)純(chún)度不(bù)要求(qiú)很高，但應(yīng)盡(jìn)量(liáng)不(bù)含(hán)有(yǒu)對PCR反應有抑製作(zuò)用(yòng)的雜(zá)質存在(zài)，如蛋白酶(méi)，核酸酶，Taq DNA聚合酶(méi)抑(yì)製劑，能與DNA結合的(dí)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)。

二，引(yǐn)物（primers)

人(rén)工(gōng)合成(chéng)的(dí)一對引物(wù)可(kě)以分(fēn)別與兩條(tiáo)模(mó)板DNA互補結合(hé)的寡核(hé)苷酸(suān)序列，其(qí)中(zhōng)一(yī)條稱為(wéi)上遊引(yǐn)物，另一條稱(chēng)為(wéi)下遊引物。引物是PCR特(tè)異(yì)性反(fǎn)應的關(guān)鍵，PCR產物的特(tè)異性取(qǔ)決(jué)於引物(wù)與(yǔ)模板DNA互補(bǔ)的程(chéng)度。理論上，隻要知(zhī)道任(rèn)何一段(duàn)模(mó)板DNA序列，就能按(àn)其設計互補(bǔ)的(dí)寡(guǎ)核苷(gān)酸鏈(liàn)做引(yǐn)物，利用PCR就(jiù)可將(jiāng)模(mó)板(bǎn)DNA在(zài)體(tǐ)外大(dà)量擴(kuò)增。引(yǐn)物濃(nóng)度(dù)一般為0.1~0.5umol/L，濃度過高(gāo)會引起錯(cuò)配和非(fēi)特(tè)異(yì)擴增(zēng)，濃度(dù)過(guò)低則得不(bù)到產物或(huò)產量過(guò)低。引物長度(dù)一般(bān)為(wéi)15~30bp,引物過長或過(guò)短(duǎn)都會(huì)降低(dī)特異(yì)性(xìng)。其3'末端(duān)一定要(yào)與模板(bǎn)DNA配對，末位鹼基最(zuì)好(hǎo)選(xuǎn)用(yòng)A，C，G(因T錯配(pèi)也能引(yǐn)發鏈的延伸)。引(yǐn)物GC占45%~55%，鹼基應(yīng)盡量隨(suí)機(jī)分布(bù)，避(bì)免嘧啶(dìng)或(huò)嘌呤堆(duī)積，兩(liǎng)引物之間(jiān)不(bù)應有互(hù)補(bǔ)鏈存在，不能與(yǔ)非(fēi)目的擴增區(qū)有同源性(xìng)。

三(sān)，底物(dNTP)

dNTP包括dATP，dTTP，dGTP，dCTP。dNTP溶液呈(chéng)酸(suān)性(xìng)，使(shǐ)用(yòng)時應配成高(gāo)濃度後，以(yǐ)1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩衝液將其pH調節至7.0~7.5，小量分(fēn)裝(zhuāng)，-20℃冰凍(dòng)保(bǎo)存。一般(bān)存儲濃度為(wéi)10mo/L，各成分以等(děng)當量配(pèi)製，反(fǎn)應(yīng)終濃(nóng)度為20~200umol/L，如(rú)其(qí)中任(rèn)何一種濃度(dù)不同(tóng)於其他(tā)幾種時(shí)（偏高(gāo)或偏低），就(jiù)會引起錯配(pèi)。高濃度可加(jiā)速(sù)反(fǎn)應(yīng)，但同時增加錯誤摻入和實驗成(chéng)本；低濃度可(kě)提(tí)高(gāo)精(jīng)確性，而(ér)反應速度會降低。dNTP的質量(liáng)與濃度和PCR擴增效(xiào)率有密(mì)切(qiē)關係，dNTP粉呈顆粒(lì)狀，如保存不當(dāng)易變性失去(qù)生物學活(huó)性(xìng)。多(duō)次凍融(róng)會使dNTP降(jiàng)解。dNTP能與(yǔ)Mg2+結合，使(shǐ)遊離的(dí)Mg2+濃(nóng)度(dù)降(jiàng)低。當(dāng)PCR需(xū)要(yào)較(jiào)高(gāo)濃度(dù)的dNTP時，應在(zài)反應體(tǐ)係中(zhōng)適當(dāng)增加Mg2+的(dí)濃度。

四，DNA聚(jù)合(hé)酶

PCR所(suǒ)用(yòng)的酶主(zhǔ)要有(yǒu)Taq和Pfu兩(liǎng)種來源，分(fēn)別(bié)來(lái)自(zì)兩種不(bù)同(tóng)的噬(shì)熱菌。其(qí)中(zhōng)，Taq擴(kuò)增效(xiào)率(shuài)高但易發生(shēng)錯配：Pfu擴(kuò)增(zēng)效率弱(ruò)但(dàn)有(yǒu)糾錯功(gōng)能。所以(yǐ)，實際(jì)使用(yòng)時必須根(gēn)據需(xū)要(yào)做不(bù)同的(dí)選擇(zé)。目前(qián)使(shǐ)用最多(duō)的是Taq酶(méi)。該酶在(zài)92.5℃，95.0℃和97.5℃時(shí)，其(qí)半衰(shuāi)期分別為(wéi)130分鐘，40分(fēn)鐘和5~6分鐘(zhōng)，可(kě)見該酶(méi)具(jù)有(yǒu)良(liáng)好的(dí)熱穩定(dìng)性。Taq酶還具有(yǒu)良好的延(yán)伸效率，其(qí)生(shēng)物(wù)學(xué)活(huó)性(xìng)在75~80℃時(shí)最(zuì)高，一般(bān)用72℃，每一個酶(méi)蛋白分子(zǐ)每(měi)秒(miǎo)可延伸(shēn)約150個核苷酸(suān)。在70℃時(shí)，延伸(shēn)速率(shuài)為60個核(hé)苷酸/秒以(yǐ)上。當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，該酶(méi)延伸速率明顯(xiǎn)下(xià)降，可(kě)能與引物—模板遭到破壞有關(guān)。其(qí)最適pH值(zhí)為(wéi)8.3~8.5，能(néng)催化(huà)以DNA單鏈為模板，以鹼(jiǎn)基(jī)互(hù)補原則為基礎(chǔ)，按5'→3'方向逐個將dNTP分子(zǐ)連(lián)接(jiē)到引(yǐn)物的(dí)3'端，合(hé)成一(yī)條與模(mó)板DNA互補的(dí)新(xīn)的(dí)DNA子(zǐ)鏈(liàn)，無3'→5'的外(wài)切(qiē)酶(méi)活(huó)性(xìng)，沒有(yǒu)校正功(gōng)能。某(mǒu)種dNTP或(huò)Mg2+濃(nóng)度(dù)過(guò)高(gāo)，會(huì)增(zēng)加其錯(cuò)配率。用(yòng)量一(yī)般(bān)為(wéi)0.5~5.0個單位/100uL。

五，PCR緩(huǎn)衝液(PCR buffer)

緩衝液(yè)的成(chéng)分(fēn)最(zuì)為(wéi)復(fù)雜，除(chú)水外一般(bān)包(bāo)括四(sì)種(zhǒng)有(yǒu)效(xiào)成(chéng)分：①緩衝體(tǐ)係，一般(bān)使用HEPES或(huò)MOPS緩(huǎn)衝(chōng)體(tǐ)係；②一價陽離子(zǐ)，一般采用(yòng)鉀(jiǎ)離(lí)子，但在(zài)特(tè)殊情況下也可使用銨根(gēn)離子(zǐ)；③二(èr)價陽離(lí)子，即鎂(měi)離子，根據(jù)反應體係確定(dìng)，除特(tè)殊情況外不需(xū)調(tiáo)整；④輔助成(chéng)分(fēn)，常(cháng)見的(dí)有DMSO，甘油(yóu)等，主要(yào)用(yòng)來保(bǎo)持(chí)酶的(dí)活性(xìng)和幫助DNA接觸(chù)纏(chán)繞(rào)結構(gòu)。

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