蛋白(bái)表達(dá)實驗(yàn)的(dí)時，有(yǒu)時(shí)候實(shí)驗會覺(jué)得參(cān)考實(shí)驗方(fāng)法(fǎ)和克(kè)隆(lóng)的(dí)蛋白基(jī)因(yīn)序列(liè)wan全沒有問題，但蛋白電(diàn)泳就是(shì)沒有結果(guǒ)。下(xià)麵(miàn)讓我(wǒ)們一(yī)起來看看蛋白表(biǎo)達的常(cháng)見問題有哪些吧！

1，載(zǎi)體(tǐ)構建(jiàn)錯(cuò)誤，很(hěn)多(duō)克隆新(xīn)人經常弄(nòng)錯(cuò)讀碼(mǎ)框。比如(rú)Qiagen的pQE係列(liè)載體(tǐ)，其克(kè)隆位(wèi)點常有一兩個鹼基的區(qū)別；另(lìng)外有些(xiē)酶產生粘(nián)端有些酶(méi)產(chǎn)生平端，這(zhè)些都容(róng)易導致(zhì)讀(dú)碼(mǎ)框(kuàng)錯誤(wù)，從(cóng)而表(biǎo)達不出來(lái)。

2，宿(sù)主(zhǔ)菌選擇(zé)不當，不同(tóng)的宿主(zhǔ)菌其基(jī)因(yīn)型是(shì)不(bù)一樣(yàng)的(dí)。有些(xiē)經(jīng)過特殊(shū)修(xiū)飾的載(zǎi)體，或(huò)者(zhě)特殊(shū)用途(tú)的(dí)載體，或者有(yǒu)特殊(shū)啟(qǐ)動(dòng)子的載體，必須選擇(zé)合適(shì)的宿(sù)主(zhǔ)菌(jūn)進(jìn)行(háng)表達。因此，當你的(dí)蛋白沒(méi)有表達出(chū)來(lái)時，可以(yǐ)考慮更(gēng)換宿(sù)主菌(jūn)。

3，密碼子的(dí)使用頻率低(dī)。有(yǒu)些(xiē)基因其本(běn)身含(hán)有許多稀(xī)有密碼子，尤其是(shì)起始密(mì)碼之(zhī)後的15個(gè)鹼(jiǎn)基之內的(dí)稀有(yǒu)密碼子(zǐ)，對蛋白表達(dá)有(yǒu)著很(hěn)重(zhòng)要(yào)的影響(xiǎng)。優化(huà)密(mì)碼子(zǐ)對(duì)原核表(biǎo)達似乎(hū)效果(guǒ)很好，對(duì)真(zhēn)核表達係統未見(jiàn)得(dé)有很(hěn)好的(dí)效果。

4，質粒不穩(wěn)定(dìng)或者質粒丟失。pET係統(tǒng)通(tōng)常(cháng)比較穩定(dìng)。但是(shì)你(nǐ)選用帶(dài)氨(ān)苄(biàn)青(qīng)黴素抗(kàng)性(xìng)的(dí)載(zǎi)體時，也許(xǔ)有(yǒu)可能產(chǎn)生β-lactamase降解了(liǎo)抗(kàng)生素，使質粒(lì)丟失(shī)。還(huán)有(yǒu)一種情(qíng)況(kuàng)是表達重(zhòng)組的(dí)毒素蛋白，對宿(sù)主細胞(bāo)也(yě)有毒(dú)性(xìng)，造成質(zhì)粒(lì)丟(diū)失。這種(zhǒng)情(qíng)況多見(jiàn)於(yú)真(zhēn)核表達係統。

5，蛋白(bái)酶(méi)將蛋白降(jiàng)解了。這(zhè)種(zhǒng)情況常由重組(zǔ)蛋白(bái)本(běn)身(shēn)的(dí)N-或C-端序(xù)列引起(qǐ)的。當蛋白(bái)N-端是(shì)Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基(jī)酸時(shí)，容易遭(zāo)受蛋白(bái)酶(méi)降(jiàng)解(jiě)，此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時(shí)，大(dà)腸杆菌可(kě)以悄悄地把這個Met偷走，特別(bié)是(shì)Met後緊(jǐn)跟(gēn)著(zhuó)一(yī)個帶小(xiǎo)側(cè)鏈(liàn)的(dí)氨基酸時(shí)。C-末(mò)端(duān)存(cún)在(zài)非極(jí)性氨基酸(suān)時(shí)，也容易導致蛋白被降解。C末端最後5個氨基酸是極性(xìng)的(dí)或者(zhě)帶(dài)電荷的，則不易被降(jiàng)解。

6，二級翻譯起始(shǐ)位點。這(zhè)種情況(kuàng)見於你(nǐ)的序(xù)列(liè)裏(lǐ)正好(hǎo)含有(yǒu)和核(hé)糖(táng)體結(jié)合位(wèi)點wan全(quán)一(yī)致(zhì)的(dí)序列。那就(jiù)怪(guài)不(bù)得(dé)人家(jiā)了(liǎo)，核(hé)糖體會(huì)很高興地找(zhǎo)到這個位(wèi)點，然(rán)後(hòu)開始翻(fān)譯(yì)，致(zhì)使你的蛋白(bái)被截短(duǎn)，在電泳(yǒng)時(shí)看不到預期大小的片(piàn)段(duàn)。

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