細胞(bāo)克隆(lóng)形(xíng)成(chéng)實驗是(shì)用來(lái)檢(jiǎn)測(cè)細胞增(zēng)殖(zhí)能力(lì)，侵襲性，對殺傷(shāng)因(yīn)素敏感(gǎn)性(xìng)等項(xiàng)目的重(zhòng)要(yào)技(jì)術(shù)方(fāng)法。克(kè)隆(lóng)形成依(yī)據采(cǎi)用(yòng)的培養介質的不同，可(kě)分為平(píng)板(bǎn)克隆和(hé)軟瓊脂(zhī)克隆兩類(lèi)。那麼你知道(dào)這兩(liǎng)種細胞(bāo)克隆實驗的操(cāo)作(zuò)方法嗎(má)？讓我們一起來看看(kàn)吧！

一，平板克隆

1. 所需(xū)材料

基(jī)礎培養基（根據(jù)細胞(bāo)選(xuǎn)擇適用(yòng)種類(lèi)）

胎牛(niú)血清，胰(yí)蛋白(bái)酶(méi)，PBS，青(qīng)黴素-鏈(liàn)黴素(sù)溶(róng)液（100X），多(duō)聚(jù)甲(jiǎ)醛固(gù)定，結晶紫(zǐ)染液，Giemsa染液，

2. 實驗(yàn)步(bù)驟

（1）6孔板(bǎn)

1）將(jiāng)處於(yú)對數生長期的細(xì)胞(bāo)胰酶(méi)消(xiāo)化後(hòu)，wan全培(péi)養(yǎng)基(jī)（基礎(chǔ)培養(yǎng)基(jī)+10%胎牛(niú)血(xiě)清）重懸成(chéng)細胞(bāo)懸(xuán)液，並計(jì)數(shù)；

2）細胞接種(zhǒng)：於6孔(kǒng)板培養板中各實(shí)驗(yàn)組(zǔ)接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔(kǒng)（根據(jù)細胞(bāo)生(shēng)長情況確(què)定，一般為700個(gè)細(xì)胞(bāo)/孔(kǒng)）;

3）繼續培養到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克(kè)隆中(zhōng)細(xì)胞數大(dà)於(yú)50為止(zhǐ)，中途每隔3天進行換液(yè)並觀察(chá)細胞狀態；

4）克隆完成(chéng)後(hòu)，在顯(xiǎn)微鏡下對細胞進行拍(pāi)照，然後(hòu)PBS洗滌(dí)1次(cì)，每孔加(jiā)入1 mL 4%多聚(jù)甲醛(quán)固定30-60 min，PBS洗(xǐ)滌1次(cì)；

5）每孔加入(rù)結晶紫染液1ml，染細胞10-20 min；

6）PBS 洗滌細(xì)胞(bāo)數次，晾(liàng)幹，數碼(mǎ)相機拍照（分(fēn)別(bié)對整(zhěng)個六(liù)孔板(bǎn)及每個孔進行單(dān)獨拍照）。

（2）平(píng)皿(mǐn)

1）取(qǔ)對數生(shēng)長(cháng)期的各組細胞(bāo)，分別用0.25%胰(yí)蛋(dàn)白酶(méi)消化並吹打(dǎ)成(chéng)單(dān)個(gè)細胞，並把(bǎ)細(xì)胞(bāo)懸浮(fú)在(zài)wan全培養基（基礎培養基+10%胎牛血(xiě)清(qīng)）中備用。

2）將(jiāng)細(xì)胞(bāo)懸液作梯度倍(bèi)數稀釋，每組5個平行樣(yàng)。每組(zǔ)細胞(bāo)每(měi)皿(mǐn)分別接種100個(gè)細胞(bāo)於含(hán)10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液(yè)的皿(mǐn)中(zhōng)，並(bìng)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使(shǐ)細胞分(fēn)散(sàn)均匀(yún)。

3）置(zhì)37℃，5% CO2及飽和(hé)濕(shī)度的(dí)細胞培養箱中培(péi)養2～3周(zhōu)。

4）當(dāng)培養(yǎng)皿中出現肉眼可見(jiàn)的克隆(lóng)時(shí)，終(zhōng)止(zhǐ)培養。棄去(qù)上(shàng)清液(yè)，用PBS小心浸洗2次。

5）加純(chún)甲醇或1:3醋(cù)酸(suān)/甲醇5ml，固(gù)定(dìng)15分鐘。

6）去(qù)固定(dìng)液，加(jiā)適量Giemsa應(yīng)用(yòng)染色液染(rǎn)10～30分鐘(zhōng)

7）用流(liú)水(shuǐ)緩慢洗(xǐ)去染(rǎn)色(sè)液(yè)，空(kōng)氣幹燥。

8）將(jiāng)平皿倒置並疊(dié)加一(yī)張帶網格的透明膠片(piàn)，用肉(ròu)眼直(zhí)接(jiē)計數克(kè)隆(lóng)，或(huò)在顯(xiǎn)微(wēi)鏡（低倍(bèi)鏡）計(jì)數大於10個細胞(bāo)的(dí)克(kè)隆(lóng)數。最(zuì)後(hòu)計算克隆(lóng)形(xíng)成率(shuài)。

克隆形(xíng)成率=（克隆數/接種細胞(bāo)數）×100%

3. 數(shù)據分(fēn)析

顯微鏡(jìng)下觀(guān)察(chá)陽性克(kè)隆(lóng)，即(jí)每個克隆(lóng)>50個細胞，相(xiāng)機拍照(zhào)，數(shù)克(kè)隆數(shù)（大(dà)小約(yuē)在0.3-1.0 mm）計算克(kè)隆(lóng)形(xíng)成(chéng)率(shuài)，並統(tǒng)計(jì)克隆大(dà)小(xiǎo)。

二，軟(ruǎn)瓊(qióng)脂克隆形成

軟瓊脂克隆(lóng)形成(chéng)又名非錨定依(yī)賴性生長(cháng)實驗Anchorage-independent assay，利用(yòng)軟瓊(qióng)脂(zhī)為(wéi)培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞(bāo)在懸(xuán)浮(fú)狀態下生(shēng)長(cháng)。
某些惡(è)性(xìng)腫(zhǒng)瘤細胞(bāo)，不僅在貼壁狀(zhuàng)態下能增(zēng)殖，在懸浮狀態下(xià)也能增殖，進(jìn)而(ér)通過(guò)軟(ruǎn)瓊(qióng)脂中形成克隆的能力(lì)反映了惡性(xìng)程度，可用於細胞(bāo)分化的基礎研(yán)究(jiū)和(hé)臨床(chuáng)腫瘤治療的(dí)療效(xiào)檢(jiǎn)驗等方麵(miàn)。

1. 實(shí)驗(yàn)步(bù)驟

1）配製(zhì)1.2% 和0.7%瓊(qióng)脂(zhī)，高壓(yā)滅菌(jūn)後，維(wéi)持在42℃中使其(qí)不(bù)會凝(níng)固；

2）將1.2% 瓊(qióng)脂與2×培養基混合，鋪(pū)入(rù)6孔板(bǎn)作為(wéi)下層膠(jiāo)，每(měi)孔1.5ml，37°C孵(fū)育30 min使(shǐ)之(zhī)凝固；

3）將製備(bèi)好(hǎo)的單(dān)細胞懸(xuán)液與(yǔ)0.7%瓊脂(zhī)充分(fēn)混匀(yún)，加(jiā)入(rù)6孔(kǒng)板作為(wéi)上層(céng)膠(jiāo)，每孔1.5ml。待其(qí)凝固後(hòu)，再在上麵加入培養基(jī)，每3天(tiān)更(gēng)換(huàn)一次(cì)；

4）根據(jù)細胞(bāo)的(dí)生(shēng)長速度培(péi)養2~3周後(hòu)顯(xiǎn)微(wēi)鏡下觀察(chá)克隆(lóng)大小，與(yǔ)平板(bǎn)克隆一(yī)樣(yàng)，每個(gè)克隆(lóng)>50個(gè)細胞，顯(xiǎn)微(wēi)鏡拍照(zhào)。若拍(pāi)整(zhěng)個孔，每(měi)孔加(jiā)入(rù)200μl氯化硝基四氮唑(zuò)藍（NBT）染色(sè)，37°C過夜(yè)，拍照。

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