產品名稱：abclonal愛博泰克(kè)TBK1/NAK兔(tù)單(dān)抗(A3458)現(xiàn)貨(huò)供應(yīng)

產品(pǐn)貨號：A3458

產品(pǐn)品(pǐn)牌(pái)：abclonal愛博泰克(kè)

實(shí)驗流程(chéng)：

蛋白免(miǎn)疫印跡實驗步驟：

1，樣品(pǐn)製備

（1）細胞收集(jí)

a. 貼壁培(péi)養細(xì)胞(bāo)收集

用(yòng)細胞刮刮(guā)下細胞(bāo)或用胰酶(méi)消(xiāo)化(huà)處理後，400×g，離心5 min，棄(qì)上清(qīng)；用適(shì)量冰PBS溶液(yè)將離(lí)心(xīn)後細胞沉(chén)澱(diàn)重(zhòng)懸(xuán)，4℃，400×g 離心(xīn)5min,棄上清，重復(fù)清(qīng)洗步驟(zhòu)一(yī)次收(shōu)集(jí)細胞(bāo)沉澱。

b. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞收(shōu)集(jí)

收集懸(xuán)浮細胞(bāo)，400×g離心5min，棄上清，適(shì)量冰PBS溶液將(jiāng)離(lí)心後(hòu)細胞(bāo)沉(chén)澱重懸(xuán)，4℃，400×g 離(lí)心5min,棄上(shàng)清(qīng)，重(zhòng)復清洗(xǐ)步驟一(yī)次(cì)，收集細胞沉(chén)澱(diàn)。

c. 組織(zhī)樣(yàng)本(běn)收(shōu)集

把組(zǔ)織在(zài)預冷(lěng)的(dí)表(biǎo)麵上剪切成細小碎塊(kuài)，然後用液氮或超(chāo)低溫(wēn)冰(bīng)箱(xiāng)中冷凍(dòng)組(zǔ)織30min以(yǐ)上(shàng)，迅速加液(yè)氮(dàn)研磨，研磨(mó)過程(chéng)盡量(liáng)控製(zhì)在1~2min之內，以減(jiǎn)少(shǎo)蛋白(bái)的降解(jiě)。

（2）總(zǒng)蛋白提(tí)取

a. 細胞/組織裂解(jiě)：

根據(jù)收(shōu)集(jí)的(dí)細胞(bāo)數(shù)量(liáng)，細胞種(zhǒng)類添(tiān)加適量的裂解(jiě)液(yè)。

例(lì)如常(cháng)規細(xì)胞沉(chén)澱可按(àn)照1mL裂解液/107個細胞的(dí)比(bǐ)例加(jiā)入相應(yīng)體積(jī)的裂(liè)解液，加(jiā)入(rù)裂解(jiě)液後(hòu)將(jiāng)沉澱吹(chuī)打混(hùn)匀。使(shǐ)用細胞(bāo)破碎儀超(chāo)聲樣本，每(měi)次(cì)超聲(shēng)時間(jiān)4-5s,間隔時(shí)間在(zài)5s左右，肉眼觀察(chá)，樣(yàng)本(běn)為均一(yī)，不(bù)粘稠(chóu)液體(tǐ)即可。或(huò)采(cǎi)用震蕩裂(liè)解方式(shì)進(jìn)行，每隔(gé)5min將離心(xīn)管(guǎn)置於渦(wō)旋振蕩儀上(shàng)震(zhèn)蕩(dàng)10s，裂解20min。

組(zǔ)織碎片(piàn)可按照0.5mL 裂(liè)解(jiě)液(yè)/100mg組(zǔ)織向匀漿(jiāng)器中(zhōng)加入蛋白裂解液(yè)，每3min研磨(mó)一(yī)次，重復5次(cì)，使組(zǔ)織盡量(liáng)碾碎(suì)（裂解(jiě)液中(zhōng)根據(jù)需要(yào)添加(jiā)或不添(tiān)加(jiā)蛋白酶抑(yì)製劑）。所(suǒ)有理解(jiě)過程(chéng)，務必(bì)在(zài)低溫條(tiáo)件(jiàn)下進(jìn)行。

b. 離(lí)心(xīn)：

把裂解(jiě)好的樣品(pǐn)配平(píng)後(hòu)，將裂解好的(dí)樣本置於預冷的高速冷凍(dòng)離(lí)心機中，13000×g離心(xīn)10min，收集上清

c. 蛋(dàn)白變性(xìng)：

吸取少量(liáng)蛋(dàn)白提(tí)取液做蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)測定。向剩餘(yú)的蛋(dàn)白提取液的(dí)離(lí)心管(guǎn)中(zhōng)加(jiā)入對(duì)應(yīng)體(tǐ)積的5× Loading Buffer（最(zuì)終工作液為1×)，待幹式(shì)恒溫(wēn)器(qì)溫度升至95℃後，將1.5mL離心(xīn)管(guǎn)插(chā)入加熱(rè)孔中，95℃加熱(rè)變性10min，待(dài)液體(tǐ)冷(lěng)卻(què)後置於(yú)-20℃保存。

（3）蛋(dàn)白(bái)濃度測(cè)定（BCA法(fǎ)）

a. BCA工作液的配(pèi)置

根據樣品數量(liáng)，按(àn)50體積(jī)BCA試劑A加入(rù)1體積(jī)BCA試(shì)劑B（50:1）配置(zhì)適量BCA工(gōng)作液(yè)，充分混匀。BCA工作(zuò)液室溫24h內穩定(dìng)。

b. BSA標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)梯度(dù)稀釋

取(qǔ)10μl蛋白(bái)標準(zhǔn)品（5 mg/mL BSA）稀(xī)釋(shì)至50μl，使終(zhōng)濃(nóng)度(dù)為1mg/ml。稀釋後的蛋白標準(zhǔn)品可(kě)以-20℃長期(qī)保存(cún)。此(cǐ)標準品(pǐn)溶液(yè)的(dí)稀釋液(yè)可(kě)使(shǐ)用(yòng)去(qù)離子水或1×PBS。將(jiāng)標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加(jiā)入到96孔板中，加(jiā)稀釋液補足到20μl。

c. 樣本濃(nóng)度(dù)測定

加(jiā)適當體積樣品到96孔板的樣(yàng)品孔中(zhōng)，如(rú)果樣本不(bù)足20μl，需(xū)加稀釋液(yè)補足到20μl。每孔加入(rù) 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶(méi)標儀(yí)測(cè)定樣本(běn)和(hé)標準品在562nm下的吸光(guāng)度(dù)，或在540-595nm之間波長(cháng)下(xià)的(dí)吸光度。根據(jù)BSA蛋白濃度標準曲綫和使(shǐ)用的(dí)樣(yàng)品體(tǐ)積計算出樣品(pǐn)的蛋(dàn)白濃(nóng)度。

2，凝膠電泳

（1）製膠(jiāo)器安裝

根據(jù)使(shǐ)用(yòng)說明(míng)書安(ān)裝(zhuāng)。

（2）凝膠配(pèi)置

根據(jù)目標蛋白大(dà)小(xiǎo)，選(xuǎn)擇不同(tóng)合(hé)適濃(nóng)度(dù)的分(fēn)離膠（見附(fù)表(biǎo)）。注(zhù)意該(gāi)過程(chéng)注意不能(néng)有氣(qì)泡產生(shēng)。

（3）上(shàng)樣(yàng)

待(dài)膠凝固(gù)好(hǎo)後(hòu)，用移液(yè)器吸(xī)取(qǔ)樣品垂直梳(shū)孔上(shàng)樣，建(jiàn)議總蛋白(bái)上樣量(liáng)25ug/孔。注意(yì)內槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注滿(mǎn)，外(wài)槽(cáo)Tris-Glycine SDS Running Buffer沒(méi)過底(dǐ)部(bù)3~5cm即可(kě)。

（4）電(diàn)泳(yǒng)

上樣完成後，連(lián)通電泳儀(yí)電源，注意正(zhèng)負極(jí)需連(lián)接(jiē)正確(què)，設(shè)定(dìng)適(shì)宜(yí)的(dí)電(diàn)泳參數。建議濃縮膠電泳參(cān)數為(wéi)恒(héng)壓80V，分離膠(jiāo)采(cǎi)用恒壓120V。當溴酚藍(lán)電泳到凝(níng)膠(jiāo)底(dǐ)部時(shí)，停(tíng)止電(diàn)泳，關(guān)閉(bì)電泳(yǒng)儀電源。

3，轉(zhuǎn)膜

（1）準備(bèi)工作

a. 轉(zhuǎn)膜(mó)緩衝液可(kě)提(tí)前2h （即開始(shǐ)電泳後）放入-20℃冰箱預(yù)冷。

b. 根(gēn)據(jù)膠(jiāo)的麵積大小，將(jiāng)濾紙(zhǐ)以及NC膜(mó)剪裁(cái)至(zhì)合適尺寸。

c. 建(jiàn)議目的(dí)蛋白(bái)大(dà)於20KD可(kě)選(xuǎn)擇0.45μm NC膜(mó)；目(mù)的蛋白小於20KD可選擇(zé)0.2μm的NC膜(mó)或0.22μm的(dí)PVDF膜。選擇完(wán)畢後(hòu)將(jiāng)膜(mó)放在Western Transfer Buffer中(zhōng)浸(jìn)泡(pào)備用。注(zhù)意(yì)使用(yòng)PVDF膜(mó)需(xū)先放(fàng)入甲醇中浸泡1min左(zuǒ)右(yòu)至(zhì)均(jūn)匀浸透(tòu)，沒有(yǒu)白點即可(kě)放入Western Transfer Buffer中浸泡(pào)備用(yòng)。

（2）轉膜(mó)

根據(jù)目的蛋白大小，選(xuǎn)擇(zé)合(hé)適的轉膜條件（見(jiàn)附表(biǎo)）。

4，封閉

轉(zhuǎn)膜(mó)完(wán)成(chéng)後，將(jiāng)膜(mó)取出(chū)，放(fàng)入合適的抗體孵育槽中，加入(rù)Western Blocking Buffer 室溫(wēn)孵育(yù)1h，加(jiā)入(rù)TBST Buffer洗滌3次(cì)，每次(cì)5 min。

5，抗體(tǐ)孵育(yù)

根(gēn)據(jù)所使用(yòng)的一(yī)抗(kàng)種類(lèi)，選擇進行下(xià)述其(qí)中1項的(dí)具(jù)體(tǐ)步驟(zhòu)

（1）對於無(wú)偶(ǒu)聯(lián)的一(yī)抗

a. 將(jiāng)一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照(zhào)抗(kàng)體(tǐ)說明書推薦(jiàn)比(bǐ)例進(jìn)行稀(xī)釋,室溫孵(fū)育1.5h或(huò)4℃過(guò)夜孵(fū)育(yù)。

b. TBST Buffer洗(xǐ)滌4次(cì)，每次5 min。

c. 按(àn)一(yī)抗(kàng)來源選取合(hé)適的(dí)HRP偶聯二抗，按照(zhào)合(hé)適比(bǐ)例(lì)進行(háng)稀(xī)釋(shì)，室(shì)溫(wēn)孵(fū)育1h。

d. TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)4次，每(měi)次5 min。

e. 繼續進行(háng)後續曝光操作。

（2）對(duì)於偶聯(lián)有HRP的一抗

a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說明書(shū)推薦(jiàn)比例進行(háng)稀釋,室溫(wēn)孵(fū)育1.5h或(huò)4℃過(guò)夜(yè)孵育。

b. 用TBST Buffer洗滌4次(cì)，每次(cì)5 min。

c. 繼續(xù)進行後續曝(pù)光操作(zuò)。

6，曝光(guāng)

a. 吸取等體積(jī)ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀，配(pèi)製(zhì)成發(fā)光檢(jiǎn)測(cè)工作(zuò)液。推(tuī)薦(jiàn)用量為每10cm2的(dí)膜使用1-2 mL發(fā)光檢(jiǎn)測(cè)工作液即可。

b. 用(yòng)鑷子將膜取出，膜(mó)的(dí)下緣輕輕接(jiē)觸吸水(shuǐ)紙，去除膜上(shàng)多(duō)餘(yú)的(dí)液體。用移(yí)液(yè)槍(qiāng)吸取(qǔ)工(gōng)作液(yè)並(bìng)均匀覆(fù)蓋(gài)轉(zhuǎn)印膜，室溫(wēn)孵(fū)育 1-2 minutes，此步驟(zhòu)可在(zài)潔(jié)淨保鮮膜(mó)上或(huò)塑料(liào)盒中(zhōng)完(wán)成(chéng)。

c. 獲(huò)取(qǔ)WB結(jié)果(guǒ)：

1) 傳(chuán)統壓(yā)片曝(pù)光(guāng)顯影：將膜固定於(yú)片夾(jiā)內(nèi)。暗(àn)室(shì)內壓片(piàn)1分鐘，立(lì)即(jí)顯(xiǎn)影定影(yǐng)，根據(jù)結果再調整(zhěng)壓(yā)片(piàn)時間獲取最(zuì)佳信噪比圖片(piàn)。或直(zhí)接分別壓(yā)片 30 秒(miǎo)，1，3，5分鐘，然後一(yī)起(qǐ)顯影定影(yǐng)觀察結果。

2) 化學發光(guāng)成(chéng)像儀(yí)獲取電子圖片：將膜放(fàng)置到成(chéng)像儀內(nèi)，參考(kǎo)儀(yí)器說明書(shū)設置(zhì)合(hé)適(shì)的參數(shù)以獲取優化圖片(piàn)。同(tóng)時(shí)應根據靶(bǎ)蛋白(bái)的(dí)生物學性(xìng)質如(rú)豐(fēng)度(dù)等(děng)來調(tiáo)節(jié)成像(xiàng)參數。

相(xiāng)關文(wén)獻：

[1] Mycobacterium tuberculosis suppresses host DNA repair to boost its intracellular survival;

[2] Biomineralized MnO₂ Nanoplatforms Mediated Delivery of Immune Checkpoint Inhibitors with STING Pathway Activation to Potentiate Cancer Radio-Immunotherapy;

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