產(chǎn)品名稱
：abclonal愛(ài)博泰克BRCA1兔(tù)多(duō)抗(kàng)(A11034)現貨(huò)供應(yīng)

產(chǎn)品貨號(hào)
：A11034

產(chǎn)品(pǐn)品(pǐn)牌
：abclonal愛博泰克

實(shí)驗(yàn)流程
：

蛋白(bái)免疫印(yìn)跡實驗(yàn)步(bù)驟
：

1
，樣(yàng)品製備(bèi)

（1）細胞收集

a. 貼壁培(péi)養細(xì)胞收(shōu)集(jí)

用細胞刮刮下細胞(bāo)或用(yòng)胰(yí)酶消化處理後
，400×g
，離(lí)心5 min
，棄(qì)上清；用適量(liáng)冰PBS溶液將離心後細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)重懸(xuán)
，4℃
，400×g 離心5min,棄(qì)上(shàng)清(qīng)
，重復清洗步驟(zhòu)一次(cì)收(shōu)集細(xì)胞沉澱。

b. 懸浮培養細(xì)胞收(shōu)集

收集懸浮細胞
，400×g離(lí)心(xīn)5min
，棄上清(qīng)
，適量冰(bīng)PBS溶液將(jiāng)離心(xīn)後(hòu)細胞沉(chén)澱重(zhòng)懸(xuán)
，4℃
，400×g 離心5min,棄(qì)上清(qīng)
，重(zhòng)復(fù)清(qīng)洗(xǐ)步(bù)驟(zhòu)一(yī)次
，收集細(xì)胞沉澱。

c. 組(zǔ)織(zhī)樣本收集

把組(zǔ)織在預冷的(dí)表麵(miàn)上(shàng)剪切成(chéng)細(xì)小(xiǎo)碎塊
，然後用液氮(dàn)或(huò)超低(dī)溫冰箱中冷(lěng)凍組(zǔ)織30min以上
，迅速(sù)加液(yè)氮研(yán)磨
，研(yán)磨過程盡(jìn)量控製(zhì)在(zài)1~2min之內
，以(yǐ)減少(shǎo)蛋白的(dí)降解。

（2）總蛋白提取

a. 細胞/組織(zhī)裂解
：

根據(jù)收集的(dí)細(xì)胞(bāo)數(shù)量(liáng)
，細胞種類添(tiān)加適量的裂(liè)解(jiě)液。

例(lì)如常規(guī)細胞(bāo)沉澱(diàn)可按(àn)照1mL裂(liè)解液/107個細胞(bāo)的(dí)比(bǐ)例加入相應(yīng)體積(jī)的裂(liè)解(jiě)液(yè)
，加(jiā)入裂(liè)解液(yè)後將沉澱(diàn)吹打混(hùn)匀(yún)。使用(yòng)細(xì)胞(bāo)破碎儀(yí)超聲樣(yàng)本
，每次超聲(shēng)時(shí)間4-5s,間(jiān)隔(gé)時間(jiān)在5s左右(yòu)
，肉眼觀(guān)察(chá)
，樣本為均(jūn)一(yī)
，不粘(nián)稠(chóu)液(yè)體(tǐ)即(jí)可(kě)。或采用震蕩(dàng)裂解(jiě)方式(shì)進(jìn)行(háng)
，每隔(gé)5min將離(lí)心(xīn)管(guǎn)置於渦(wō)旋(xuán)振蕩(dàng)儀(yí)上震蕩10s
，裂(liè)解20min。

組(zǔ)織(zhī)碎(suì)片可按照0.5mL 裂解液/100mg組(zǔ)織向匀漿(jiāng)器中(zhōng)加入蛋白(bái)裂(liè)解液(yè)
，每3min研(yán)磨一次
，重復5次
，使組(zǔ)織(zhī)盡(jìn)量碾碎（裂(liè)解(jiě)液中根據(jù)需要添(tiān)加(jiā)或不添加蛋白酶抑(yì)製劑(jì)）。所有理(lǐ)解過(guò)程
，務(wù)必(bì)在低溫條(tiáo)件下(xià)進(jìn)行。

b. 離(lí)心(xīn)
：

把裂(liè)解好的(dí)樣(yàng)品配平(píng)後(hòu)
，將裂(liè)解好(hǎo)的(dí)樣本置於(yú)預冷的高速冷凍離心機(jī)中
，13000×g離心(xīn)10min
，收(shōu)集上清(qīng)

c. 蛋白變性(xìng)
：

吸取(qǔ)少(shǎo)量蛋(dàn)白提取液做蛋(dàn)白(bái)濃度(dù)測(cè)定。向剩(shèng)餘的蛋白提(tí)取液的離(lí)心管(guǎn)中(zhōng)加(jiā)入(rù)對(duì)應體積的(dí)5× Loading Buffer（最終工作液(yè)為1×)
，待(dài)幹(gān)式(shì)恒溫(wēn)器溫度升(shēng)至(zhì)95℃後
，將1.5mL離心管插(chā)入加(jiā)熱(rè)孔中
，95℃加熱(rè)變性10min
，待液體冷卻後(hòu)置(zhì)於(yú)-20℃保存(cún)。

（3）蛋白濃度(dù)測(cè)定(dìng)（BCA法）

a. BCA工(gōng)作液(yè)的(dí)配(pèi)置

根(gēn)據(jù)樣品(pǐn)數量
，按50體(tǐ)積(jī)BCA試劑A加(jiā)入(rù)1體積BCA試劑B（50:1）配置適(shì)量(liáng)BCA工(gōng)作液
，充分混匀(yún)。BCA工作液(yè)室溫(wēn)24h內穩(wěn)定。

b. BSA標準品梯(tī)度(dù)稀(xī)釋

取(qǔ)10μl蛋白(bái)標準品（5 mg/mL BSA）稀釋至(zhì)50μl
，使終(zhōng)濃度為1mg/ml。稀釋後的蛋白(bái)標準(zhǔn)品(pǐn)可以(yǐ)-20℃長期保存。此(cǐ)標準品溶液的(dí)稀(xī)釋液(yè)可(kě)使(shǐ)用(yòng)去離(lí)子(zǐ)水或1×PBS。將(jiāng)標(biāo)準(zhǔn)品按0
，1
，2
，4
，8
，12
，16
，20μl加(jiā)入到96孔板(bǎn)中(zhōng)
，加稀釋液(yè)補(bǔ)足到20μl。

c. 樣(yàng)本(běn)濃(nóng)度(dù)測定

加適當(dāng)體(tǐ)積樣品到(dào)96孔板的(dí)樣品(pǐn)孔(kǒng)中
，如(rú)果(guǒ)樣(yàng)本不足20μl
，需(xū)加稀釋(shì)液補足到(dào)20μl。每(měi)孔加入 200μl BCA工(gōng)作液(yè)
，37℃放置(zhì)20-30min。用(yòng)酶(méi)標儀測定樣本和標準品(pǐn)在562nm下(xià)的吸光度(dù)
，或在540-595nm之(zhī)間波長下的(dí)吸光度。根據BSA蛋(dàn)白(bái)濃度標準曲(qū)綫(xiàn)和使用(yòng)的(dí)樣品(pǐn)體(tǐ)積計(jì)算(suàn)出(chū)樣(yàng)品(pǐn)的蛋白濃(nóng)度。

2
，凝(níng)膠電(diàn)泳(yǒng)

（1）製(zhì)膠(jiāo)器安裝

根據使用說(shuō)明書安裝。

（2）凝(níng)膠(jiāo)配置(zhì)

根據(jù)目(mù)標(biāo)蛋(dàn)白大(dà)小
，選擇不(bù)同合適濃(nóng)度的分離(lí)膠(jiāo)（見附(fù)表(biǎo)）。注(zhù)意該(gāi)過程注(zhù)意不(bù)能有氣(qì)泡產生(shēng)。

（3）上樣

待膠凝固(gù)好後
，用移液器(qì)吸(xī)取(qǔ)樣品垂直梳(shū)孔(kǒng)上樣(yàng)
，建(jiàn)議總(zǒng)蛋(dàn)白上樣量25ug/孔(kǒng)。注意內槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需(xū)注滿
，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過底部3~5cm即可。

（4）電(diàn)泳(yǒng)

上樣(yàng)完(wán)成(chéng)後(hòu)
，連通(tōng)電泳(yǒng)儀電源(yuán)
，注意(yì)正(zhèng)負極(jí)需(xū)連接正(zhèng)確(què)
，設(shè)定適(shì)宜的電泳參數。建(jiàn)議(yì)濃(nóng)縮膠(jiāo)電(diàn)泳參(cān)數為(wéi)恒(héng)壓(yā)80V
，分離膠(jiāo)采用恒壓120V。當溴酚藍電泳到凝(níng)膠底(dǐ)部時
，停止(zhǐ)電(diàn)泳
，關(guān)閉(bì)電(diàn)泳儀(yí)電源(yuán)。

3
，轉膜

（1）準備工(gōng)作(zuò)

a. 轉(zhuǎn)膜緩衝(chōng)液可(kě)提前(qián)2h （即開始電泳後）放入(rù)-20℃冰(bīng)箱(xiāng)預(yù)冷(lěng)。

b. 根據膠(jiāo)的(dí)麵(miàn)積(jī)大(dà)小(xiǎo)
，將濾紙(zhǐ)以及NC膜(mó)剪(jiǎn)裁至合(hé)適尺(chǐ)寸(cùn)。

c. 建(jiàn)議(yì)目(mù)的蛋白大於20KD可(kě)選擇0.45μm NC膜(mó)；目(mù)的蛋(dàn)白(bái)小(xiǎo)於20KD可選擇(zé)0.2μm的(dí)NC膜(mó)或(huò)0.22μm的(dí)PVDF膜。選擇(zé)完畢後(hòu)將(jiāng)膜放在Western Transfer Buffer中浸泡(pào)備用。注意使(shǐ)用PVDF膜需先(xiān)放(fàng)入(rù)甲醇(chún)中(zhōng)浸泡(pào)1min左(zuǒ)右至均(jūn)匀浸(jìn)透
，沒有白點即可(kě)放(fàng)入Western Transfer Buffer中浸(jìn)泡(pào)備用(yòng)。

（2）轉(zhuǎn)膜

根據目(mù)的(dí)蛋(dàn)白大(dà)小(xiǎo)
，選(xuǎn)擇(zé)合適的轉膜條件(jiàn)（見附(fù)表）。

4
，封(fēng)閉

轉(zhuǎn)膜完成後(hòu)
，將膜(mó)取(qǔ)出
，放(fàng)入合適的抗體(tǐ)孵(fū)育槽(cáo)中
，加入(rù)Western Blocking Buffer 室(shì)溫孵育1h
，加(jiā)入TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)3次
，每次5 min。

5
，抗體(tǐ)孵育(yù)

根據所使(shǐ)用的一抗種(zhǒng)類
，選擇(zé)進行下述其(qí)中1項的具(jù)體步(bù)驟

（1）對於無偶聯的一抗

a. 將一(yī)抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照(zhào)抗體說(shuō)明書(shū)推(tuī)薦(jiàn)比例進行(háng)稀釋,室溫孵育(yù)1.5h或4℃過(guò)夜孵(fū)育。

b. TBST Buffer洗滌(dí)4次
，每(měi)次(cì)5 min。

c. 按一(yī)抗來源選取合適的HRP偶聯二抗
，按照(zhào)合適比例進行稀(xī)釋
，室(shì)溫(wēn)孵(fū)育(yù)1h。

d. TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)4次
，每次5 min。

e. 繼(jì)續(xù)進(jìn)行後(hòu)續曝光操作(zuò)。

（2）對於(yú)偶聯有HRP的(dí)一(yī)抗

a. 將(jiāng)一抗(kàng)用(yòng)Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按(àn)照抗體說明書(shū)推薦比(bǐ)例(lì)進(jìn)行(háng)稀(xī)釋,室溫(wēn)孵(fū)育(yù)1.5h或(huò)4℃過(guò)夜孵育。

b. 用(yòng)TBST Buffer洗(xǐ)滌4次
，每次5 min。

c. 繼續(xù)進行(háng)後(hòu)續曝(pù)光操作。

6
，曝(pù)光

a. 吸取(qǔ)等體(tǐ)積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混(hùn)匀
，配製成發光檢測(cè)工作液。推(tuī)薦用量(liáng)為(wéi)每10cm2的膜(mó)使用(yòng)1-2 mL發(fā)光(guāng)檢(jiǎn)測工作液(yè)即(jí)可(kě)。

b. 用(yòng)鑷(niè)子將(jiāng)膜取出
，膜的下(xià)緣輕(qīng)輕(qīng)接(jiē)觸吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)
，去除膜(mó)上多餘的液(yè)體(tǐ)。用(yòng)移液槍吸取(qǔ)工(gōng)作(zuò)液並均匀(yún)覆(fù)蓋(gài)轉印膜
，室(shì)溫(wēn)孵育 1-2 minutes
，此步(bù)驟(zhòu)可在(zài)潔淨保鮮膜(mó)上或塑料盒(hé)中完成。

c. 獲(huò)取(qǔ)WB結果
：

1) 傳統壓(yā)片曝光顯(xiǎn)影
：將(jiāng)膜固定於片夾內(nèi)。暗室(shì)內(nèi)壓(yā)片1分(fēn)鐘
，立即顯影(yǐng)定(dìng)影(yǐng)
，根據結果(guǒ)再調整(zhěng)壓(yā)片(piàn)時(shí)間(jiān)獲取最(zuì)佳信(xìn)噪比圖片(piàn)。或直接分別壓片 30 秒
，1
，3
，5分(fēn)鐘
，然後(hòu)一起顯(xiǎn)影定(dìng)影(yǐng)觀(guān)察(chá)結(jié)果。

2) 化(huà)學發光(guāng)成像(xiàng)儀(yí)獲取(qǔ)電子圖片(piàn)
：將膜放置到成像儀內
，參(cān)考儀器說明書(shū)設置(zhì)合(hé)適的(dí)參數(shù)以獲(huò)取(qǔ)優化圖(tú)片。同時(shí)應根(gēn)據(jù)靶蛋白(bái)的(dí)生(shēng)物學性(xìng)質(zhì)如(rú)豐(fēng)度等來調節(jié)成(chéng)像參數(shù)。

相(xiāng)關文(wén)獻(xiàn)
：

[1] Gene dosage effects of poly(A) track-engineered hypomorphs;

[2] The P286R mutation of DNA polymerase ε activates cancer-cell-intrinsic immunity and suppresses endometrial tumorigenesis via the cGAS-STING pathway - PMC.

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