產品名(míng)稱(chēng)：abclonal愛(ài)博泰(tài)克HRP偶(ǒu)聯山羊抗(kàng)兔IgG(H+L)(AS014)現貨供應(yīng)

產(chǎn)品貨(huò)號：AS014

產(chǎn)品品牌(pái)：abclonal愛博(bó)泰克

實驗流(liú)程(chéng)：

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)步(bù)驟：

1，樣品(pǐn)製(zhì)備(bèi)

（1）細(xì)胞(bāo)收(shōu)集

a. 貼壁(bì)培養(yǎng)細(xì)胞收集(jí)

用(yòng)細(xì)胞(bāo)刮(guā)刮下細胞或(huò)用胰(yí)酶消(xiāo)化(huà)處理(lǐ)後，400×g，離心(xīn)5 min，棄(qì)上清；用適量(liáng)冰PBS溶液(yè)將離心後細(xì)胞沉(chén)澱重(zhòng)懸，4℃，400×g 離(lí)心(xīn)5min,棄(qì)上清(qīng)，重(zhòng)復(fù)清(qīng)洗(xǐ)步驟一(yī)次收集細(xì)胞沉澱。

b. 懸(xuán)浮培(péi)養(yǎng)細胞(bāo)收(shōu)集(jí)

收(shōu)集(jí)懸浮(fú)細胞，400×g離(lí)心5min，棄上清(qīng)，適(shì)量冰(bīng)PBS溶(róng)液(yè)將(jiāng)離心(xīn)後細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)重(zhòng)懸，4℃，400×g 離心5min,棄(qì)上(shàng)清，重復清洗步驟一(yī)次(cì)，收集細胞沉(chén)澱。

c. 組(zǔ)織(zhī)樣本收集

把組織(zhī)在(zài)預冷的表(biǎo)麵上(shàng)剪切(qiē)成細(xì)小(xiǎo)碎(suì)塊(kuài)，然後用(yòng)液(yè)氮或超低溫冰箱中(zhōng)冷凍組織30min以上(shàng)，迅(xùn)速加(jiā)液氮研磨(mó)，研磨(mó)過程(chéng)盡量(liáng)控(kòng)製在1~2min之(zhī)內(nèi)，以(yǐ)減少蛋白的(dí)降(jiàng)解。

（2）總(zǒng)蛋(dàn)白提取(qǔ)

a. 細胞(bāo)/組織裂(liè)解(jiě)：

根(gēn)據(jù)收(shōu)集(jí)的細(xì)胞(bāo)數(shù)量(liáng)，細胞(bāo)種類添(tiān)加(jiā)適量的裂解(jiě)液。

例(lì)如常規細胞沉澱(diàn)可(kě)按(àn)照(zhào)1mL裂(liè)解液(yè)/107個細(xì)胞(bāo)的(dí)比例加(jiā)入相應體(tǐ)積(jī)的裂解液(yè)，加入裂(liè)解(jiě)液後將沉澱(diàn)吹(chuī)打(dǎ)混匀(yún)。使用細胞破碎(suì)儀超聲(shēng)樣本，每次(cì)超聲(shēng)時間4-5s,間隔時間在(zài)5s左右，肉(ròu)眼(yǎn)觀(guān)察(chá)，樣本為均(jūn)一，不(bù)粘(nián)稠液(yè)體即(jí)可(kě)。或采用震蕩裂解方(fāng)式(shì)進行(háng)，每隔5min將離心管置於渦旋振(zhèn)蕩儀上震蕩10s，裂解20min。

組(zǔ)織碎片(piàn)可按(àn)照0.5mL 裂(liè)解液(yè)/100mg組織(zhī)向匀(yún)漿(jiāng)器中加入蛋白裂解液(yè)，每3min研(yán)磨一(yī)次(cì)，重復5次，使(shǐ)組(zǔ)織盡量(liáng)碾碎（裂(liè)解液(yè)中(zhōng)根據需要添加或不添加蛋白(bái)酶抑(yì)製(zhì)劑）。所(suǒ)有理解過(guò)程，務必(bì)在低(dī)溫條(tiáo)件(jiàn)下(xià)進(jìn)行(háng)。

b. 離(lí)心(xīn)：

把(bǎ)裂(liè)解好(hǎo)的樣品配(pèi)平(píng)後，將裂解(jiě)好的(dí)樣本(běn)置於(yú)預(yù)冷的(dí)高速冷(lěng)凍(dòng)離(lí)心(xīn)機(jī)中，13000×g離(lí)心(xīn)10min，收(shōu)集上(shàng)清(qīng)

c. 蛋(dàn)白變性(xìng)：

吸(xī)取少量蛋白(bái)提(tí)取液(yè)做(zuò)蛋(dàn)白濃度測定(dìng)。向剩餘的蛋(dàn)白提取(qǔ)液的離心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)加(jiā)入對(duì)應體積(jī)的(dí)5× Loading Buffer（最終工(gōng)作(zuò)液為(wéi)1×)，待(dài)幹式恒(héng)溫(wēn)器溫(wēn)度升(shēng)至95℃後(hòu)，將1.5mL離(lí)心(xīn)管(guǎn)插入加熱(rè)孔中(zhōng)，95℃加熱(rè)變性10min，待(dài)液(yè)體(tǐ)冷卻(què)後置(zhì)於-20℃保存(cún)。

（3）蛋白濃(nóng)度測定（BCA法(fǎ)）

a. BCA工作(zuò)液的配(pèi)置

根據(jù)樣品(pǐn)數(shù)量，按50體積(jī)BCA試(shì)劑A加入1體積(jī)BCA試劑(jì)B（50:1）配(pèi)置(zhì)適量BCA工作(zuò)液，充分混匀(yún)。BCA工作液(yè)室溫(wēn)24h內(nèi)穩定(dìng)。

b. BSA標(biāo)準品(pǐn)梯(tī)度(dù)稀釋(shì)

取(qǔ)10μl蛋白標準品（5 mg/mL BSA）稀釋至50μl，使終(zhōng)濃度(dù)為(wéi)1mg/ml。稀釋(shì)後的(dí)蛋(dàn)白(bái)標準(zhǔn)品可以(yǐ)-20℃長期(qī)保存(cún)。此標準品溶液的稀(xī)釋液(yè)可使(shǐ)用(yòng)去(qù)離(lí)子水或(huò)1×PBS。將(jiāng)標準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加入到96孔(kǒng)板(bǎn)中，加(jiā)稀釋液(yè)補足到20μl。

c. 樣(yàng)本(běn)濃度測定

加(jiā)適當體積(jī)樣品到(dào)96孔(kǒng)板的樣品孔中(zhōng)，如(rú)果(guǒ)樣(yàng)本不(bù)足20μl，需加稀釋(shì)液(yè)補(bǔ)足到20μl。每孔加入(rù) 200μl BCA工作液(yè)，37℃放置20-30min。用酶標儀測定(dìng)樣(yàng)本(běn)和(hé)標準品在562nm下(xià)的吸光度(dù)，或在540-595nm之間波長下的吸(xī)光(guāng)度。根據(jù)BSA蛋白(bái)濃度標準曲(qū)綫(xiàn)和使用(yòng)的(dí)樣(yàng)品(pǐn)體積(jī)計算(suàn)出(chū)樣(yàng)品的蛋(dàn)白濃(nóng)度(dù)。

2，凝膠電泳(yǒng)

（1）製膠(jiāo)器安裝

根(gēn)據(jù)使用(yòng)說明書安裝。

（2）凝膠(jiāo)配(pèi)置(zhì)

根(gēn)據目標(biāo)蛋白(bái)大(dà)小(xiǎo)，選擇不同合(hé)適濃度(dù)的分離膠（見(jiàn)附(fù)表）。注意該過程注(zhù)意不(bù)能有氣(qì)泡(pào)產生。

（3）上樣

待膠(jiāo)凝固(gù)好後，用移液(yè)器吸(xī)取(qǔ)樣(yàng)品垂(chuí)直梳孔上樣(yàng)，建(jiàn)議總蛋白上樣量25ug/孔(kǒng)。注意內槽(cáo)Tris-Glycine SDS Running Buffer需注滿(mǎn)，外槽(cáo)Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過(guò)底部(bù)3~5cm即(jí)可。

（4）電(diàn)泳(yǒng)

上樣(yàng)完(wán)成後，連通電泳(yǒng)儀電(diàn)源，注意正(zhèng)負極(jí)需連接正(zhèng)確，設定適(shì)宜(yí)的電(diàn)泳參(cān)數。建議(yì)濃縮膠(jiāo)電(diàn)泳參數為恒壓(yā)80V，分(fēn)離膠采用恒壓120V。當(dāng)溴酚(fēn)藍(lán)電(diàn)泳(yǒng)到(dào)凝膠底部時，停止電泳，關(guān)閉電泳(yǒng)儀(yí)電(diàn)源(yuán)。

3，轉膜

（1）準備工作(zuò)

a. 轉(zhuǎn)膜緩衝(chōng)液(yè)可提(tí)前2h （即開始(shǐ)電泳後(hòu)）放入(rù)-20℃冰(bīng)箱(xiāng)預冷。

b. 根據(jù)膠的(dí)麵積大小，將(jiāng)濾紙(zhǐ)以及(jí)NC膜剪裁至合適尺寸。

c. 建議目(mù)的蛋(dàn)白(bái)大(dà)於(yú)20KD可(kě)選擇(zé)0.45μm NC膜(mó)；目的(dí)蛋白小(xiǎo)於(yú)20KD可(kě)選擇(zé)0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜(mó)。選擇完(wán)畢後(hòu)將(jiāng)膜(mó)放(fàng)在Western Transfer Buffer中浸泡備(bèi)用(yòng)。注(zhù)意(yì)使用PVDF膜(mó)需先放入甲醇中(zhōng)浸(jìn)泡1min左(zuǒ)右至均(jūn)匀(yún)浸透，沒有白點即(jí)可(kě)放(fàng)入(rù)Western Transfer Buffer中浸泡(pào)備用。

（2）轉(zhuǎn)膜

根(gēn)據目的蛋白(bái)大小(xiǎo)，選(xuǎn)擇(zé)合適的(dí)轉(zhuǎn)膜條件（見附(fù)表）。

4，封(fēng)閉

轉(zhuǎn)膜(mó)完成(chéng)後，將(jiāng)膜取出，放(fàng)入(rù)合(hé)適(shì)的抗(kàng)體孵(fū)育槽中，加入Western Blocking Buffer 室(shì)溫(wēn)孵育1h，加入TBST Buffer洗滌3次，每(měi)次(cì)5 min。

5，抗(kàng)體孵育

根據(jù)所使用(yòng)的一抗種類，選(xuǎn)擇(zé)進行下(xià)述(shù)其中1項的具(jù)體(tǐ)步驟

（1）對於無偶(ǒu)聯的一抗

a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說(shuō)明書(shū)推薦比例(lì)進行稀(xī)釋,室溫(wēn)孵(fū)育1.5h或(huò)4℃過夜(yè)孵(fū)育(yù)。

b. TBST Buffer洗滌4次(cì)，每(měi)次5 min。

c. 按(àn)一(yī)抗(kàng)來源選取合(hé)適(shì)的(dí)HRP偶(ǒu)聯二抗，按照合(hé)適(shì)比例進行稀(xī)釋，室(shì)溫孵育(yù)1h。

d. TBST Buffer洗滌(dí)4次(cì)，每次(cì)5 min。

e. 繼續進行後續(xù)曝(pù)光操作。

（2）對於(yú)偶聯有HRP的一抗

a. 將一抗(kàng)用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按(àn)照抗體說明書(shū)推(tuī)薦比例進(jìn)行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過(guò)夜(yè)孵(fū)育(yù)。

b. 用(yòng)TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)4次，每(měi)次5 min。

c. 繼(jì)續進(jìn)行後續曝光操作。

6，曝光(guāng)

a. 吸取等(děng)體積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀，配(pèi)製成(chéng)發(fā)光檢測工(gōng)作液。推(tuī)薦(jiàn)用量為每(měi)10cm2的(dí)膜(mó)使用1-2 mL發(fā)光檢測(cè)工作(zuò)液即可。

b. 用鑷(niè)子(zǐ)將膜(mó)取(qǔ)出，膜的(dí)下緣輕(qīng)輕接(jiē)觸吸水(shuǐ)紙(zhǐ)，去除(chú)膜(mó)上多餘的液(yè)體(tǐ)。用移液槍(qiāng)吸取(qǔ)工(gōng)作液並(bìng)均匀覆蓋(gài)轉印(yìn)膜，室溫孵(fū)育 1-2 minutes，此步驟可(kě)在潔淨(jìng)保鮮膜(mó)上或(huò)塑(sù)料(liào)盒(hé)中(zhōng)完成(chéng)。

c. 獲取(qǔ)WB結果(guǒ)：

1) 傳統壓片曝光(guāng)顯影：將(jiāng)膜固(gù)定(dìng)於片(piàn)夾(jiā)內(nèi)。暗(àn)室(shì)內壓片(piàn)1分鐘，立即顯影定(dìng)影，根(gēn)據結果再調整壓片時(shí)間獲(huò)取最佳(jiā)信噪比(bǐ)圖片(piàn)。或直(zhí)接(jiē)分(fēn)別壓片 30 秒，1，3，5分(fēn)鐘，然(rán)後一起(qǐ)顯影(yǐng)定影觀(guān)察結果(guǒ)。

2) 化(huà)學發光(guāng)成像儀獲(huò)取電子(zǐ)圖(tú)片：將膜放(fàng)置到成像儀(yí)內，參(cān)考儀器說(shuō)明(míng)書(shū)設(shè)置(zhì)合適的(dí)參(cān)數(shù)以(yǐ)獲(huò)取(qǔ)優化(huà)圖(tú)片。同時應(yīng)根據(jù)靶(bǎ)蛋(dàn)白(bái)的(dí)生物學性(xìng)質如豐(fēng)度等(děng)來調節(jié)成像參數(shù)。

相(xiāng)關文獻(xiàn)：

[1] Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism - PMC;

[2] Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression.

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