細胞(bāo)凍存(cún)是細胞保存(cún)的主要方(fāng)法之一。利用凍存技(jì)術(shù)將細胞置於-196℃液(yè)氮(dàn)中(zhōng)低(dī)溫保存(cún)，可以使(shǐ)細胞(bāo)暫時脫離(lí)生(shēng)長狀(zhuàng)態而(ér)將其(qí)細胞特(tè)性保存起來，這(zhè)樣(yàng)在需(xū)要的時候再(zài)復(fù)蘇細(xì)胞用於實(shí)驗。既可以防止(zhǐ)因(yīn)正在培養(yǎng)的細(xì)胞被汙(wū)染或(huò)其他意(yì)外事件(jiàn)而(ér)使(shǐ)細胞丟種(zhǒng)，又起(qǐ)到(dào)了細胞(bāo)保(bǎo)種的作用。那(nà)麼(mó)你知(zhī)道細(xì)胞(bāo)凍存(cún)的操作步驟是什(shí)麼嗎(má)？讓我們一(yī)起來看看吧
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　　實驗(yàn)開(kāi)始前，要先做(zuò)好準備工作：
 

　　將凍(dòng)存管，離(lí)心(xīn)管，移液管，移(yí)液(yè)器等(děng)耗材(cái)準備齊全(quán)，放(fàng)入(rù)超(chāo)淨(jìng)台(tái)中(zhōng)，打開(kāi)紫外綫照(zhào)射(shè) 30 分鐘(zhōng)。打(dǎ)開(kāi)通風(fēng)機通風 3 分鐘(zhōng)。用 75%酒精擦拭(shì)操作(zuò)台(tái)和雙手。準備好冰盒。將離心機(jī)調節(jié)至所(suǒ)需(xū)轉(zhuǎn)速(sù)，細胞完全(quán)培(péi)養(yǎng)基，DMSO，胰(yí)酶等放(fàng)於37℃水浴(yù)箱中預(yù)熱。
 

　　凍存步驟：
 

　　1. 取出細胞，酒(jiǔ)精(jīng)消毒(dú)，放入(rù)超(chāo)淨台。
 

　　Tip1：應在細胞生長良(liáng)好，致密(mì)度約為 80-90%，活力達 90%以上的狀態下凍存。細胞活(huó)力差的細胞在凍(dòng)存(cún)後的(dí)成(chéng)活率很(hěn)小(xiǎo)，因此，一定要(yào)在(zài)細胞(bāo)旺盛分裂時期凍存。
 

　　2. 配置細胞凍存液(yè)：按(àn)無血清培(péi)養基(jī)：血(xiě)清(qīng)：DMSO=7:2:1 的比例配(pèi)置細胞凍存(cún)液。【或(huò)者(zhě)血(xiě)清：DMSO=9：1，亦可以(yǐ)根據細胞特(tè)性(xìng)，選(xuǎn)擇供(gōng)應商推薦(jiàn)的(dí)凍存液配方(fāng)】。
 

　　Tip2：DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級，無菌(jūn)且無色(sè)，可以用0.22微米濾膜(mó)過(guò)濾，或(huò)者(zhě)直(zhí)接(jiē)購(gòu)買無菌產(chǎn)品(pǐn)。以(yǐ)5-10 ml小體(tǐ)積分裝，4℃避(bì)光保存，勿作多(duō)次解(jiě)凍(dòng)。
 

　　Tip3：因DMSO本身就有滅菌(jūn)的作用，因此(cǐ)使(shǐ)用前不需要(yào)進(jìn)行高(gāo)壓(yā)滅(miè)菌。高(gāo)壓滅菌反(fǎn)而(ér)會破壞它的分(fēn)子(zǐ)結構，以至於降(jiàng)低冷(lěng)凍保存效(xiào)果。
 

　　Tip4：在常溫(wēn)下，DMSO對(duì)人體有害，應注意生物(wù)安全防(fáng)護。
 

　　Tip5：凍(dòng)存(cún)液應(yīng)該提前配製，防止(zhǐ)臨(lín)時配製(zhì)產(chǎn)生的熱量損傷(shāng)細胞。
 

　　Tip6：加大凍存液中血清(qīng)的比例(lì)對(duì)於(yú)保存(cún)某些脆弱的幹細(xì)胞(bāo)以(yǐ)及(jí)一些比較(jiào)珍(zhēn)貴(guì)的(dí)細(xì)胞(bāo)很有(yǒu)好(hǎo)處的。
 

　　3. 按照(zhào)細(xì)胞傳(chuán)代步驟(zhòu)，對細(xì)胞進行(háng)消(xiāo)化，解(jiě)離。
 

　　4. 消(xiāo)化(huà)好的(dí)細(xì)胞(bāo)離(lí)心(xīn)後，棄(qì)掉(diào)上(shàng)清液，用凍存液重(zhòng)懸(xuán)。
 

　　Tip7：用移液(yè)器吸去上清液時(shí)，不要吸到底部的(dí)細胞沉(chén)澱。
 

　　Tip8：用移(yí)液器(qì)輕柔(róu)吹打(dǎ)細胞，避免損傷(shāng)細(xì)胞(bāo)。
 

　　Tip9：混匀 DMSO 要(yào)快(kuài)，因(yīn)為 DMSO 對細(xì)胞(bāo)有毒性，混合後應(yīng)盡快凍(dòng)存。
 

　　5. 可用細(xì)胞計數(shù)板(bǎn)或計數(shù)儀(yí)器對細(xì)胞進行計數(shù)，將(jiāng)細(xì)胞(bāo)總數調節至細(xì)胞數(shù)量(liáng)為(wéi)5×105/ml為宜(yí)。
 

　　6. 將細(xì)胞凍(dòng)存懸(xuán)液分(fēn)裝入(rù)細胞凍(dòng)存管(guǎn)中，一(yī)般2ml凍存管(guǎn)裝入(rù) 1 -1.5 ml細(xì)胞(bāo)凍(dòng)存懸液為宜(yí)。
 

　　7. 放(fàng)入專(zhuān)業(yè)的細胞凍(dòng)存盒中，或者(zhě)按照：
 

　　﹣4 ℃ 30分鐘→20℃ 30分鐘→﹣80℃過(guò)夜→液(yè)氮保存的(dí)順序進行凍存。
 

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