一(yī)，實(shí)驗原理

BCA(bicinchoninic acid,二辛(xīn)可(kě)酸(suān))法，測定蛋(dàn)白(bái)質即在鹼性條件(jiàn)下蛋白(bái)質與(yǔ)Cu2+絡合(hé)，並將(jiāng)其(qí)還原成(chéng)Cu1+。Cu1+和(hé)BCA試劑反應(yīng)，使其(qí)由(yóu)原來(lái)的蘋果綠(lǜ)形成(chéng)穩(wěn)定(dìng)的紫(zǐ)藍(lán)色復合物(wù)，在562 nm有強烈的光吸(xī)收，且(qiě)吸光值和(hé)蛋白質(zhì)濃度在廣泛(fàn)範圍內有良(liáng)好的綫性關(guān)係(xì)，因(yīn)此可(kě)用於(yú)蛋白質濃(nóng)度(dù)測定(dìng)。

‌二(èr)，操作步(bù)驟

準備標準(zhǔn)品(pǐn)和(hé)樣(yàng)品‌：將標準蛋白(bái)質(zhì)溶液(yè)（如牛血(xiě)清白蛋白(bái)BSA）稀釋成(chéng)一係(xì)列(liè)已知(zhī)濃(nóng)度(dù)的(dí)溶液，作為標準(zhǔn)曲綫(xiàn)。同時(shí)，將待(dài)測(cè)樣品適當稀釋(shì)，確(què)保(bǎo)其在(zài)標(biāo)準曲綫(xiàn)的(dí)綫性(xìng)範圍內(nèi)。

配製BCA工(gōng)作液(yè)‌：根據標準(zhǔn)品和樣品數量(liáng)，按(àn)照(zhào)50體積的試劑A和1體(tǐ)積(jī)的試(shì)劑(jì)B的比例(lì)配製適量(liáng)的BCA工(gōng)作(zuò)液。例如(rú)，如果測定4個(gè)樣(yàng)品，每個樣品(pǐn)做3個復(fù)孔(kǒng)，則需要配製12份200μL的工作(zuò)液(yè)。

‌加樣‌：在96孔板的相(xiāng)應孔(kǒng)中(zhōng)加入(rù)20μL的(dí)標準品(pǐn)或(huò)待(dài)測(cè)樣品(pǐn)，然後(hòu)加(jiā)入PBS或其(qí)他緩衝液至總(zǒng)體積為20μL。

‌加入BCA工(gōng)作液‌：向每個孔中加(jiā)入200μL的(dí)BCA工作液(yè)，輕(qīng)輕(qīng)混(hùn)匀。

孵(fū)育‌：將酶(méi)標板放在(zài)37℃孵育(yù)30分鐘，或者室溫下孵育(yù)2小(xiǎo)時，使反應wanquan。

測定吸(xī)光(guāng)度‌：使用(yòng)酶標儀在(zài)562nm波長(cháng)下測(cè)定各孔(kǒng)的吸(xī)光度。

繪製(zhì)標準(zhǔn)曲綫並計算樣品濃(nóng)度(dù)‌：將(jiāng)標(biāo)準品的吸(xī)光度和(hé)對應的(dí)濃度繪製(zhì)成標準曲綫。然後，將待測樣(yàng)品的吸光(guāng)度代(dài)入(rù)標(biāo)準(zhǔn)曲綫，計算(suàn)出(chū)樣品的蛋白(bái)質濃(nóng)度。

三(sān)，注意(yì)事(shì)項(xiàng)

確保所(suǒ)有操作(zuò)在無菌條(tiáo)件下進(jìn)行，避(bì)免汙(wū)染。

每次測(cè)定(dìng)最好製(zhì)作新的標(biāo)準曲綫(xiàn)，因(yīn)為(wéi)BCA反應(yīng)可(kě)能會受(shòu)溫度和(hé)時間的影響。

為(wéi)保證(zhèng)結果(guǒ)的(dí)準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品應設(shè)置至(zhì)少(shǎo)3個(gè)復(fù)孔(kǒng)，並(bìng)取平(píng)均(jūn)值(zhí)進行計算(suàn)。

注(zhù)意(yì)試劑的保存(cún)條件(jiàn)和(hé)有效期(qī)，確(què)保(bǎo)實驗(yàn)的(dí)準確性。

四，蛋白濃(nóng)度測(cè)定試(shì)劑(jì)盒推薦(jiàn)

——天(tiān)津(jīn)益元(yuán)利康生物(wù)科技(jì)有(yǒu)限(xiàn)公司！