一(yī)
，工作(zuò)原理

RNA酶保護(hù)法(fǎ)（RNase Protection Assay，RPA，以(yǐ)下簡稱(chēng)RPA），是近十(shí)年發展(zhǎn)起(qǐ)來的一種全新的(dí)mRNA定(dìng)量分析(xī)方(fāng)法(fǎ)
。

基本原(yuán)理：將標記的(dí)特(tè)異RNA探針（32P或生物(wù)素）與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的(dí)特異RNA探針按鹼基(jī)互(hù)補的(dí)原則(zé)與目(mù)的基因(yīn)特異(yì)性(xìng)結(jié)合(hé)，形(xíng)成雙鏈RNA；未結合的(dí)單(dān)鏈RNA經(jīng)RNA酶A或(huò)RNA酶(méi)T1消(xiāo)化形成寡核糖核(hé)酸(suān)，而待(dài)測目的基因與特異(yì)RNA探針結合後(hòu)形(xíng)成雙鏈RNA，免受(shòu)RNA酶的(dí)消化(huà)，故該方(fāng)法命名(míng)為RNA酶(méi)保(bǎo)護(hù)實驗(yàn)
。

二(èr)
，RPA法優點

與Northern blot和RT-PCR比(bǐ)較(jiào)，RPA有(yǒu)以下幾個優點：

1. 檢測靈敏(mǐn)度比Northern雜交高
。

由於Northern雜交步驟中轉膜(mó)和洗(xǐ)膜都(dū)將造(zào)成樣(yàng)品(pǐn)和探針的(dí)損失，使(shǐ)靈(líng)敏(mǐn)度(dù)下(xià)降(jiàng)，而(ér)RPA將(jiāng)所有(yǒu)雜交(jiāo)體係進行(háng)電泳(yǒng)，故損(sǔn)失(shī)小(xiǎo)，提(tí)高了(liǎo)靈(líng)敏(mǐn)度
。

2. 由於PCR擴增過程中(zhōng)效(xiào)率不(bù)均一(yī)和(hé)反(fǎn)應“平(píng)台(tái)"問(wèn)題(tí)，基(jī)於(yú)PCR產物量(liáng)進行(háng)分析(xī)所得數據的(dí)可靠(kào)性將下(xià)降，而RPA沒(méi)有擴增(zēng)過程，因此，分(fēn)析(xī)的(dí)數(shù)據(jù)真實性(xìng)較高(gāo)
。

3.由於與(yǔ)反(fǎn)義RNA探(tàn)針雜交(jiāo)的樣品RNA僅(jǐn)為該RNA分子(zǐ)的部(bù)分(fēn)片段，因此，部分(fēn)降解的RNA樣(yàng)品(pǐn)仍(réng)可進行分(fēn)析
。

4.步驟(zhòu)較少(shǎo)，耗(hào)時(shí)短
。與Northern雜交(jiāo)相比(bǐ)，省去(qù)了轉膜和洗膜的過程(chéng)
。

5.RNA-RNA雜交體穩定性高(gāo)，無探針自身(shēn)復性(xìng)問(wèn)題(tí)，無(wú)須(xū)封(fēng)閉(bì)
。

6.一(yī)個(gè)雜交(jiāo)體(tǐ)係(xì)中(zhōng)可(kě)同時進(jìn)行多(duō)個(gè)探針雜交，無競爭性問(wèn)題(tí)
。

7. 檢測(cè)分(fēn)子長度可以(yǐ)任(rèn)意設(shè)置，靈活性大(dà)
。

三
，RPA法(fǎ)缺(quē)點

‌RNA酶(méi)保護(hù)試(shì)驗方法的主要缺點包括(kuò)RNA探(tàn)針(zhēn)的(dí)製備(bèi)過(guò)程復雜
，核酸酶消化(huà)時酶(méi)量的控製困難(nán)
，需要(yào)使用放射性同位素(sù)
。‌

‌RNA探(tàn)針的(dí)製備(bèi)過程復(fù)雜‌：該方(fāng)法的(dí)前提(tí)是(shì)必須首先將(jiāng)研(yán)究的基因(yīn)克隆(lóng)到一個載(zǎi)體中，並(bìng)清楚插入片(piàn)段的方向(xiàng)
。載體(tǐ)插入片段(duàn)兩(liǎng)側需要(yào)有(yǒu)T3
，T7或SP6的(dí)啟動子位點
。載體需要(yào)使(shǐ)用(yòng)合(hé)適(shì)的內切(qiē)酶(méi)綫(xiàn)性(xìng)化，並選(xuǎn)擇(zé)正確的體(tǐ)外(wài)轉(zhuǎn)錄(lù)試劑盒(hé)，轉(zhuǎn)錄出要研究(jiū)的mRNA的互補(bǔ)鏈(liàn)，再(zài)進(jìn)行(háng)純(chún)化
。這(zhè)一(yī)過(guò)程相(xiāng)對繁瑣且技(jì)術(shù)要(yào)求較(jiào)高‌
。

‌核酸酶消化(huà)時酶(méi)量(liáng)的控製(zhì)困難‌：在核酸(suān)酶消(xiāo)化過程中(zhōng)，酶量(liáng)的控(kòng)製(zhì)是(shì)一個(gè)挑戰，因為酶量難以精確控(kòng)製，容(róng)易(yì)導致(zhì)消(xiāo)化過頭(tóu)，使得X片上沒(méi)有(yǒu)任(rèn)何顯(xiǎn)示
。這表(biǎo)明(míng)實驗(yàn)操作對(duì)酶(méi)量(liáng)的控製要(yào)求(qiú)非常(cháng)高，否則會(huì)影響實驗結果的(dí)準確(què)性(xìng)‌
。

‌需(xū)要(yào)使用(yòng)放射(shè)性(xìng)同位(wèi)素‌：該方(fāng)法(fǎ)需(xū)要(yào)使(shǐ)用放射性同(tóng)位素(sù)進行標記，雖然(rán)這種方(fāng)法防(fáng)護相對(duì)容易，但由(yóu)於(yú)使用(yòng)了放射性物質，需要進(jìn)行特殊的(dí)處(chǔ)理和防護措施(shī)
。此(cǐ)外，該(gāi)方法還(huán)需要進(jìn)行(háng)垂(chuí)直板狀PAGE，並且涉(shè)及到大量的放射性物質，如電泳(yǒng)緩衝(chōng)液
，電泳槽
，玻(bō)璃板
，漂洗固定液及托盤等，這(zhè)些都(dū)增加(jiā)了實(shí)驗的(dí)復(fù)雜性(xìng)和安全性考慮
。如(rú)果(guǒ)非(fēi)同(tóng)位素(sù)的(dí)標(biāo)記和(hé)檢(jiǎn)測能(néng)夠達到相同(tóng)的靈敏度(dù)和成本效(xiào)益，這(zhè)將是一個改進的方(fāng)向(xiàng)‌
。

綜(zōng)上所述(shù)，雖(suī)然RNA酶保護試驗(yàn)方法在定量分析RNA方麵具(jù)有高(gāo)靈敏度和(hé)高特(tè)異(yì)性等優點(diǎn)，但其(qí)操(cāo)作復(fù)雜
，對實(shí)驗(yàn)條(tiáo)件要(yào)求(qiú)高以及(jí)使用放(fàng)射性同(tóng)位(wèi)素(sù)的(dí)限製是其主(zhǔ)要(yào)的缺(quē)點(diǎn)
。

四(sì)
，品(pǐn)牌(pái)推薦(jiàn)

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