上(shàng)文介紹(shào)了，今(jīn)天讓(ràng)我們(mén)學習(xí)一下(xià)怎麼用流式細胞儀(yí)分(fēn)選T細胞吧(bā)~

一，樣本(běn)製備(bèi)

1.取(qǔ)樣: 取100μL抗凝血(xiě)。

2.標記：根據抗(kàng)體(tǐ)說明書標記(jì)實驗管。混匀後(hòu)，室(shì)溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血：將(jiāng)10×裂紅液用(yòng)水(shuǐ)稀釋10倍，每管(guǎn)加(jiā)入1mL，振蕩(dàng)器(qì)混(hùn)匀後室溫避光靜置10分鐘(zhōng)，300g，4°C離心(xīn)5分鐘。

4. 洗滌：棄去上(shàng)清(qīng)，加(jiā)入(rù)1mL 1×PBS洗(xǐ)液，300g離心洗滌(dí)5分(fēn)鐘(zhōng)，洗2-3次。

5. 上機檢測(cè)：棄(qì)去(qù)上(shàng)清(qīng)後(hòu)加(jiā)入500μL 1×PBS，混(hùn)匀(yún)懸(xuán)浮(fú)後過(guò)濾(lǜ)，避光等(děng)待(dài)上機檢測。

二(èr)，儀器操(cāo)作(zuò)

1. 打(dǎ)開流式細(xì)胞儀(yí)，開(kāi)啟(qǐ)液(yè)流，質控。

2. 分(fēn)選前設置：共包含兩個(gè)步驟，第一，調節(jié)合適的液流(liú)斷(duàn)點，待四路窗(chuāng)口(kǒu)形成清晰(xī)的5路液流(liú)，其(qí)中含4個(gè)收(shōu)集(jí)液流，一個廢液(yè)流(liú)後，利用“sweetspot"鎖住(zhù)此(cǐ)斷(duàn)點(diǎn)；然(rán)後利用Accudrop 珠(zhū)子(zǐ)，調整(zhěng) “Drop Delay"時間(jiān)，當左(zuǒ)側(cè)液流(liú)接近 100%，而且保(bǎo)持相對穩定(dìng)的範(fàn)圍的(dí)時間是最佳時(shí)間。

3. 設置分(fēn)析條(tiáo)件(jiàn)：完成質控後，建立用戶(hù)文(wén)件夾(jiā)，當(dāng)日實驗文件(jiàn)夾，根(gēn)據(jù)細(xì)胞(bāo)標(biāo)記，選(xuǎn)擇所(suǒ)需參數，根(gēn)據(jù)各抗原之間生(shēng)物(wù)關係(xì)及實驗(yàn)主要關(guān)注點(diǎn)，畫好(hǎo) FSC-SSC及(jí)各熒光參數兩兩相對的散(sàn)點圖，根據(jù)抗(kàng)原(yuán)生(shēng)物(wù)關(guān)係設(shè)置(zhì)分(fēn)析門，及(jí)群級聯關(guān)係表(biǎo)。

4. 確定(dìng)電(diàn)壓：先上(shàng)對(duì)照(zhào)管，根(gēn)據淋巴細胞(bāo)在 FSC-SSC散點圖(tú)中(zhōng)的位(wèi)置，調(tiáo)整 FSC和(hé)SSC兩(liǎng)個(gè)參數的電(diàn)壓，保(bǎo)證淋(lín)巴，單核及中心(xīn)粒細胞(bāo)呈(chéng)現(xiàn)在合適(shì)的位置，然後(hòu)設置(zhì)P1 門圈住(zhù)淋(lín)巴(bā)細(xì)胞；根(gēn)據陰(yīn)性細胞群(qún)位置，調(tiáo)整好(hǎo)其(qí)它熒光(guāng)參數(shù)的(dí)電(diàn)壓(yā)，記(jì)錄10000個細胞。

5. 分類計數：上(shàng)陽性管(guǎn)，通(tōng)過(guò)分級(jí)設(shè)門，完(wán)成各(gè)抗原之(zhī)間生(shēng)物關(guān)係的呈現(xiàn)，及各細胞(bāo)分類計數情況。

6. 分(fēn)選(xuǎn)設置(zhì)：在(zài)“sort layout"窗口(kǒu)，設(shè)置收集裝(zhuāng)置和純度(dù)模式(shì)，然後(hòu)設置分選門，圈(quān)住(zhù)CD4或CD8 陽性的(dí)細胞(bāo)，將(jiāng)分選門(mén)分別(bié)填入左右(yòu)“sort location field" 框中。

7. 分選(xuǎn)：將(jiāng)收集管(guǎn)中(zhōng)分別裝200ul 1XPBS，放入儀(yí)器分選倉(cāng)下麵(miàn)的收(shōu)集管架上(shàng)：點“sort"開始分選，此時(shí)“sort location field"框中可(kě)見(jiàn)所獲(huò)得(dé)的CD4或(huò)CD8陽(yáng)性的細胞數(shù)目；收(shōu)集(jí)到足(zú)夠(gòu)的目(mù)的細胞(bāo)後(hòu)，停(tíng)止(zhǐ)分選。

8.細(xì)胞純度檢測：利(lì)用(yòng)上樣針清洗(xǐ)液和(hé)水清洗上樣(yàng)針，直到(dào)以水(shuǐ)上樣(yàng)時，FSC-SSC散點圖中(zhōng)“無點(diǎn)"為止(zhǐ)。將(jiāng)分選獲(huò)得的CD4陽性細胞(bāo)上樣回測，觀(guān)察細胞分選(xuǎn)純(chún)度；再(zài)次清洗上(shàng)樣針(zhēn)，將分選獲得CD8陽性細(xì)胞上樣(yàng)回(huí)測(cè)，觀察細胞分(fēn)選純度。

通過(guò)以(yǐ)上(shàng)實驗(yàn)步驟，我們可(kě)以(yǐ)成功(gōng)分(fēn)選(xuǎn)並(bìng)收(shōu)集到特定的(dí)T細胞群(qún)體。

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