一，簡(jiǎn)介(jiè)

BeyoClick™ EdU-488細胞增殖檢測(cè)試劑(jì)盒(hé)(BeyoClick™ EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488)，是(shì)一(yī)種(zhǒng)基於(yú)DNA合成過程中(zhōng)胸(xiōng)腺(xiàn)嘧啶(dìng)脫氧核苷(gān)(thymidine)類似物(wù)EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的(dí)摻(chān)入(rù)，並通過(guò)隨(suí)後的(dí)點(diǎn)擊反(fǎn)應(Click reaction)使(shǐ)EdU被Alexa Fluor 488所(suǒ)標(biāo)記(jì)，從而實現(xiàn)簡單，快速(sù)，高靈敏(mǐn)地檢(jiǎn)測細胞增殖的(dí)試劑(jì)盒(hé)。

——天津益元利康生物(wù)科技有(yǒu)限公司，提供(gōng)碧雲天試劑盒(hé)等(děng)產品(pǐn)，歡(huān)迎咨(zī)詢！！
本(běn)試劑(jì)盒可(kě)以(yǐ)檢測(cè)到(dào)細胞或組織樣(yàng)品中單個的(dí)增殖細胞(bāo)，同時也可以對細(xì)胞(bāo)或組織樣品總(zǒng)體的細(xì)胞增殖(zhí)情況進行定量(liáng)檢測(cè)。本試(shì)劑盒(hé)可(kě)以檢(jiǎn)測培(péi)養(yǎng)的(dí)細胞(bāo)或組織樣(yàng)品，也可(kě)以檢測(cè)組織切片。
經本試(shì)劑(jì)盒(hé)處(chǔ)理後，增(zēng)殖的細(xì)胞(bāo)在熒光顯(xiǎn)微(wēi)鏡(jìng)下呈現非(fēi)常明亮的(dí)綠(lǜ)色熒光(guāng)，可以用於(yú)熒(yíng)光(guāng)顯(xiǎn)微鏡，激光共聚焦顯微鏡，流式(shì)細胞儀(yí)或(huò)熒(yíng)光酶標儀(yí)檢(jiǎn)測，也可以(yǐ)用於(yú)高內涵篩(shāi)選(High-Content Screening, HCS)。流(liú)式細(xì)胞(bāo)儀或熒光酶(méi)標(biāo)儀檢測僅適(shì)用於細(xì)胞(bāo)樣品，不(bù)適(shì)用於(yú)組(zǔ)織切(qiē)片。
細胞(bāo)增(zēng)殖能力的(dí)檢測(cè)是(shì)評(píng)估細(xì)胞(bāo)活性，基(jī)因毒性和(hé)抗(kàng)腫瘤(liú)藥(yào)物(wù)效果(guǒ)等(děng)的(dí)基本方(fāng)法。gong認(rèn)的(dí)zui精確的檢(jiǎn)測細胞增殖的方法(fǎ)是直接檢(jiǎn)測細胞中DNA的合成。最(zuì)初廣泛使用的通過(guò)檢(jiǎn)測DNA合(hé)成來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法(fǎ)是(shì)放射性(xìng)標記(jì)核苷摻入法，如(rú)氚標(biāo)記胸(xiōng)腺嘧(mì)啶脫氧(yǎng)核苷(gān)([³H]thymidine)摻入法(fǎ)。但該方法由於(yú)有放(fàng)射(shè)性汙染(rǎn)並且很(hěn)難實(shí)現單細胞(bāo)檢測而(ér)受(shòu)到很大(dà)的(dí)限(xiàn)製，隨(suí)後逐(zhú)漸(jiàn)被(bèi)基於抗(kàng)體(tǐ)檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所(suǒ)替代。BrdU法步驟(zhòu)繁多(duō)，且(qiě)需要使用BrdU抗體(tǐ)，影響因素(sù)較(jiào)多(duō)，穩定性比較(jiào)差(chà)。並(bìng)且(qiě)由(yóu)於(yú)BrdU法需(xū)要(yào)使(shǐ)用抗體，有(yǒu)時會(huì)和(hé)其(qí)它目(mù)的(dí)蛋(dàn)白基(jī)於(yú)抗(kàng)體的檢(jiǎn)測(cè)相互產(chǎn)生幹(gān)擾。EdU法基於(yú)EdU摻(chān)入(rù)和後續(xù)的(dí)點擊反(fǎn)應，無(wú)需(xū)使用抗體，操(cāo)作便捷，檢(jiǎn)測靈敏度(dù)高，是一(yī)種在BrdU法(fǎ)基礎上升級(jí)換(huàn)代的(dí)新方(fāng)法(fǎ)，將會逐步取(qǔ)代BrdU法。
MTT法(C0009)，WST-1法(C0035，C0036)，CCK-8法(fǎ)(C0037，C0038，C0039，C0040，0C0041，C0042，C0043，C0046)和(hé)CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065，C0068)都是基於細(xì)胞活(huó)性的細胞(bāo)增殖(zhí)檢測(cè)方(fāng)法，能檢(jiǎn)測到細(xì)胞的總(zǒng)體增殖效(xiào)果(guǒ)，但無(wú)法檢(jiǎn)測到單個的(dí)增(zēng)殖細胞(bāo)。這(zhè)幾(jī)種方(fāng)法盡(jìn)管(guǎn)都(dū)不是檢測DNA合成的，但被廣泛(fàn)用於替代[³H]thymidine摻入法。CFDA SE法(fǎ)(C0051，C1031)基(jī)於(yú)細胞熒光示(shì)蹤(zōng)的原理能檢測到單個(gè)的增(zēng)殖(zhí)細(xì)胞，但(dàn)由(yóu)於每增殖一次(cì)熒光減弱一半，在(zài)熒光顯微(wēi)鏡(jìng)下較難(nán)區(qū)分熒(yíng)光減(jiǎn)弱一(yī)半的細(xì)胞，檢測靈敏(mǐn)度(dù)不(bù)是(shì)很高(gāo)，通(tōng)常(cháng)僅適用(yòng)於(yú)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在(zài)進(jìn)行(háng)科學研究時，上述(shù)這些基於(yú)細(xì)胞(bāo)活性或CFDA SE的方(fāng)法可以作(zuò)為(wéi)EdU法(fǎ)的補(bǔ)充(chōng)性檢測(cè)方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中(zhōng)文(wén)名(míng)為(wéi)5-乙炔(quē)基(jī)-2' -脫氧(yǎng)尿(niào)苷，是(shì)一種新(xīn)型(xíng)胸苷(gān)(胸(xiōng)腺嘧啶脫(tuō)氧核苷，thymidine)類(lèi)似(sì)物(wù)，EdU可(kě)以在(zài)DNA合(hé)成(chéng)過(guò)程中替代胸苷摻入到新合(hé)成(chéng)的(dí)DNA中(zhōng)。另(lìng)一方麵，EdU上(shàng)的乙(yǐ)炔(quē)基能與(yǔ)熒光標記(jì)的(dí)小分子(zǐ)疊(dié)氮化(huà)物探針(zhēn)(如(rú)Azide Alexa Fluor 488，Azide Alexa Fluor 555，Azide Alexa Fluor 594，Azide Alexa Fluor 647等(děng))通(tōng)過一價銅(tóng)離子(zǐ)的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩定(dìng)的(dí)三唑(zuò)環，該反(fǎn)應非常迅速，被(bèi)稱作(zuò)點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)，其反應(yīng)原(yuán)理參見圖(tú)1。通過(guò)點(diǎn)擊反(fǎn)應，新(xīn)合成(chéng)的DNA會被相應的熒(yíng)光探針所標記，從而可以(yǐ)使用(yòng)適(shì)當(dāng)的熒光(guāng)檢(jiǎn)測設備檢測(cè)到增殖的(dí)細胞(bāo)。

圖(tú)1. BeyoClick™ EdU檢(jiǎn)測法中的(dí)點(diǎn)擊(jī)反應(Click reaction)原理圖。熒(yíng)光探(tàn)針(zhēn)等標記的疊(dié)氮化(huà)物(Labeled Azide)與摻(chān)入(rù)到細(xì)胞DNA中(zhōng)的EdU，在銅離子(zǐ)的催(cuī)化發生(shēng)共(gòng)價反應(yīng)，形成(chéng)穩(wěn)定的三(sān)唑(zuò)環，最(zuì)終使細胞DNA標記(jì)上熒光(guāng)探(tàn)針或其(qí)它探針。

二(èr)，優(yōu)勢

本試劑盒反(fǎn)應(yīng)簡(jiǎn)單，檢(jiǎn)測靈(líng)敏(mǐn)度高。本試(shì)劑(jì)盒基(jī)於(yú)簡(jiǎn)單高(gāo)效的點(diǎn)擊反(fǎn)應(yīng)，無需(xū)DNA變(biàn)性(xìng)，隻(zhī)需少(shǎo)量(liáng)的小分(fēn)子(zǐ)疊(dié)氮化(huà)物(wù)探針即可(kě)非(fēi)常(cháng)有(yǒu)效(xiào)地標記出(chū)摻(chān)入的EdU，並且可以檢測到(dào)單個細(xì)胞(bāo)的(dí)增殖(zhí)情況。

本(běn)試(shì)劑(jì)盒使(shǐ)用(yòng)便捷(jié)，兼容性好。本(běn)試劑盒(hé)隻需常用(yòng)的多聚甲醛(quán)固定(dìng)和Triton X-100穿透，就(jiù)可(kě)以使疊氮化物(wù)探(tàn)針有效(xiào)進入細胞(bāo)並發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，不(bù)會影響(xiǎng)細(xì)胞形態(tài)，不會影響(xiǎng)基於抗(kàng)體的(dí)免疫(yì)熒光(guāng)和(hé)免疫(yì)組(zǔ)化(huà)檢測，也(yě)不(bù)會(huì)影響(xiǎng)DNA的(dí)熒(yíng)光(guāng)染(rǎn)色(如PI染色(sè)檢(jiǎn)測(cè)細(xì)胞周(zhōu)期(qī)，DAPI或Hoechst染(rǎn)料檢(jiǎn)測細胞核)。而BrdU法為了(liǎo)使大分子的BrdU抗體(tǐ)進入(rù)細(xì)胞並與DNA上的(dí)BrdU結合，需要對雙鏈DNA進(jìn)行變(biàn)性處理(如酸(suān)變性，熱(rè)變性或者(zhě)DNase消化(huà)等(děng))，這種變(biàn)性可能(néng)會影響(xiǎng)細胞形(xíng)態，影(yǐng)響後續(xù)的(dí)免(miǎn)疫熒光和(hé)免疫(yì)組化檢(jiǎn)測(cè)，DNA的熒光染色(sè)等。BrdU法(fǎ)和BeyoClick™ EdU法(fǎ)檢(jiǎn)測(cè)原(yuán)理的比較參見(jiàn)圖(tú)2。

圖2. BrdU法和(hé)BeyoClick™ EdU法檢測(cè)原(yuán)理(lǐ)的比較(jiào)。A. BrdU法需使(shǐ)用大分子的BrdU抗體，由於(yú)空(kōng)間位阻，雙(shuāng)鏈(liàn)DNA須變性(xìng)後(hòu)才能使(shǐ)BrdU抗體與(yǔ)BrdU結合(hé)。B. EdU法使用(yòng)小分子(zǐ)標記(jì)的(dí)疊氮(dàn)化物(wù)(Azide)，無需(xū)DNA變(biàn)性，操作(zuò)更(gēng)便捷，兼容性(xìng)好，檢(jiǎn)測結果更(gēng)加(jiā)穩定可(kě)靠。

本試劑(jì)盒檢測快速(sù)，定(dìng)性(xìng)定量(liáng)檢(jiǎn)測都非常便捷(jié)。相對於(yú)至(zhì)少需要(yào)4小(xiǎo)時的(dí)BrdU法(fǎ)，本試(shì)劑盒(hé)采用(yòng)的(dí)BeyoClick™ EdU法檢(jiǎn)測新合(hé)成(chéng)的(dí)DNA隻需1.5-2小時，時間(jiān)上大大縮短。本(běn)試劑(jì)盒同(tóng)時提供了(liǎo)染(rǎn)色(sè)細胞核(hé)的(dí)Hoechst 33342，以方(fāng)便(biàn)染(rǎn)色(sè)觀察(chá)所有(yǒu)的細(xì)胞(bāo)
核。可(kě)以(yǐ)使用熒(yíng)光顯微鏡或流式(shì)細(xì)胞(bāo)儀等(děng)進行定性和定量檢測。HeLa細胞(bāo)用本(běn)試劑盒(hé)和熒光顯(xiǎn)微(wēi)鏡(jìng)檢測(cè)細胞增殖(zhí)的效果參見(jiàn)圖(tú)3；Jurkat細(xì)胞(bāo)用本試劑盒(hé)和(hé)流式(shì)細胞儀檢測(cè)細(xì)胞(bāo)增(zēng)殖的效果(guǒ)參(cān)見(jiàn)圖4。

圖(tú)3. HeLa細胞(bāo)用本(běn)試(shì)劑(jì)盒檢(jiǎn)測細胞(bāo)增(zēng)殖的(dí)效果圖。無EdU組觀(guān)察不(bù)到綠(lǜ)色(sè)熒光(最(zuì)左(zuǒ)側一列)；EdU (10μM)孵育(yù)2小時組有(yǒu)明(míng)亮的(dí)綠色熒光(中間一(yī)列(liè))；而用10mM的DNA合成抑製劑羥(qiǎng)基脲(niào)(Hydroxyurea)提前預(yù)處理0.5小時(shí)後(hòu)，綠(lǜ)色熒光顯著減弱(ruò)，說明DNA合(hé)成抑製(zhì)後(hòu)，EdU的摻入被顯著抑(yì)製(zhì)(最右側一(yī)列(liè))。

圖(tú)4. Jurkat細胞用本試(shì)劑(jì)盒標(biāo)記後(hòu)用流式細(xì)胞儀檢測細胞(bāo)增(zēng)殖的效(xiào)果(guǒ)圖(tú)。Jurkat細(xì)胞隻用(yòng)EdU標記(左圖)，或在標(biāo)記(jì)的(dí)同(tóng)時用10mM的DNA合成抑(yì)製(zhì)劑羥基脲(niào)(Hydroxyurea)處理(lǐ)(右(yòu)圖(tú))，2小時後用(yòng)本試劑盒(hé)進行(háng)點擊反應(yīng)，然(rán)後(hòu)用(yòng)流式細胞(bāo)儀(yí)進行(háng)檢測。從圖中可以看出(chū)，僅EdU標記的細(xì)胞有較高比(bǐ)例(lì)的(dí)綠色熒(yíng)光(488 fluorescence)陽性(xìng)細胞，呈(chéng)現綠色熒(yíng)光陰(yīn)性(弱染色)和(hé)陽(yáng)性(xìng)(強染(rǎn)色)的兩(liǎng)個(gè)峰(左(zuǒ)圖(tú))，分別對應於未(wèi)增殖細(xì)胞(bāo)和增(zēng)殖細胞(bāo)。經過羥基(jī)脲(niào)處(chǔ)理(lǐ)的細胞，綠(lǜ)色(sè)熒(yíng)光(guāng)陽性的細(xì)胞幾(jī)乎wanquan消(xiāo)失(右(yòu)圖)，僅剩下(xià)一個綠色熒(yíng)光陰(yīn)性的(dí)峰(右圖)。該(gāi)檢(jiǎn)測(cè)結果說明DNA合成被抑(yì)製(zhì)後，EdU的摻入(rù)也被(bèi)抑製。實測數據可能會(huì)因細胞類型，細胞增殖(zhí)情(qíng)況(kuàng)，檢(jiǎn)測(cè)儀器(qì)等(děng)的不同而存在(zài)差(chà)異(yì)，圖中(zhōng)數(shù)據(jù)僅(jǐn)供參(cān)考。

本試劑盒(hé)小(xiǎo)包裝C0071S如(rú)果用(yòng)於(yú)培養(yǎng)的(dí)細胞(6孔板)的(dí)檢(jiǎn)測，可(kě)以(yǐ)檢測50個樣(yàng)品，每(měi)個樣(yàng)品的(dí)反應體係(xì)為500μl的(dí)Click反應液(yè)；如(rú)果用於(yú)96孔(kǒng)板(bǎn)檢測，可以檢(jiǎn)測500個樣(yàng)品(pǐn)，每個樣品(pǐn)的檢測體(tǐ)係為50μl的Click反應(yīng)液；如(rú)果用於12孔(kǒng)，24孔，48孔(kǒng)或(huò)384孔板(bǎn)樣(yàng)品的檢測，分別可以檢(jiǎn)測(cè)125，250，350和(hé)1250個(gè)樣品(pǐn)，每個樣品推薦的(dí)Click反(fǎn)應液用量(liáng)為200μl，100μl，70μl和20μl。小包(bāo)裝如果用(yòng)於流式(shì)細胞儀檢(jiǎn)測，可以檢測(cè)50個樣品，每個細胞(bāo)樣品(pǐn)的細胞數(shù)量宜為10-100萬(wàn)，每個樣品的(dí)反應體(tǐ)係(xì)為500μl的Click反應液。小包(bāo)裝如果(guǒ)用於冰凍或石(shí)蠟(là)切片的(dí)檢測(cè)，可(kě)以檢測125-250個(gè)樣品， 每(měi)個樣品的(dí)反應(yīng)體(tǐ)係為100-200μl的Click反應液。大包裝(zhuāng)C0071L可檢測樣品的數(shù)量(liáng)為小(xiǎo)包裝C0071S的(dí)4倍。
三，包(bāo)裝清(qīng)單(dān)

保(bǎo)存條件(jiàn)：
-20℃保存(cún)，一(yī)年(nián)有效(xiào)。Azide 488和Hoechst 33342須避光保(bǎo)存(cún)。
注(zhù)意事項：
Click Additive配製(zhì)成溶液後請(qǐng)注(zhù)意(yì)適當分裝(zhuāng)。如(rú)果溶解(jiě)後(hòu)有(yǒu)白色物(wù)質(zhì)析(xī)出(chū)，請(qǐng)上下顛倒多(duō)次(cì)，待(dài)全部(bù)溶解後(hòu)使用。如果(guǒ)該(gāi)溶液(yè)顏色(sè)變(biàn)成(chéng)棕色，說(shuō)明該(gāi)組分(fēn)的(dí)有效(xiào)成(chéng)分(fēn)已失(shī)效(xiào)，請(qǐng)棄用。

四(sì)，使用說(shuō)明：
1.需(xū)要用戶自己(jǐ)準(zhǔn)備的(dí)耗(hào)材和試劑(jì)
a.碧(bì)雲(yún)天的(dí)PBS C0221A，或PBS (pH7.2-7.6)。
b.固(gù)定(dìng)液(yè)(碧雲天的免疫染色(sè)固定液P0098，或4%的(dí)多聚甲(jiǎ)醛(quán)P0099)。
c.洗滌液(yè)(免(miǎn)疫染(rǎn)色(sè)封閉(bì)液P0102，QuickBlock™免疫染色封(fēng)閉液P0260，或(huò)含3% BSA的PBS)。
d.通透(tòu)液(yè)(碧雲天的(dí)免疫染色強(qiáng)力通透(tòu)液P0097，免(miǎn)疫(yì)染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的(dí)PBS)。
e.去(qù)離(lí)子水或超純水(shuǐ)。
f.根(gēn)據(jù)實驗(yàn)要求：18×18mm蓋(gài)玻片(piàn)，6孔板或(huò)其它多孔板，或(huò)流式(shì)細(xì)胞(bāo)分析儀(yí)用(yòng)管子(如12×75mm)。
2.檢(jiǎn)測體係(xì)的(dí)準(zhǔn)備
a.如下(xià)以(yǐ)6孔(kǒng)板或(huò)常(cháng)規切片(piàn)檢(jiǎn)測(cè)體(tǐ)係為例，如果使用12孔板(bǎn)，96孔板或384孔(kǒng)板(bǎn)等孔(kǒng)板，檢(jiǎn)測體係可(kě)以相應按比例縮(suō)小(xiǎo)。
b.如果(guǒ)檢測(cè)的(dí)是(shì)懸(xuán)浮細胞(bāo)，請(qǐng)按(àn)常(cháng)規的懸(xuán)浮細胞(bāo)的(dí)操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細胞(bāo)相比(bǐ)，相關(guān)步(bù)驟(zhòu)需(xū)要增加離心(xīn)步(bù)驟(zhòu)等，如(rú)1000×g室(shì)溫(wēn)離心5min。
3.培養(yǎng)細胞的EdU標記及固(gù)定，洗滌和通透
a.在6孔(kǒng)板中(如有必(bì)要(yào)可以加入蓋(gài)玻片(piàn))培養適當數(shù)量的細(xì)胞。細胞培(péi)養過夜(yè)並(bìng)且(qiě)恢(huī)復到(dào)正常狀態(tài)後(hòu)，進(jìn)行所(suǒ)需(xū)的藥(yào)物處理或者其它刺激(jī)處理等。
b.配製(zhì)2X的EdU工作(zuò)液(yè)：由(yóu)於(yú)EdU工(gōng)作(zuò)液是(shì)與培養(yǎng)液等體積加入(rù)到孔板(bǎn)中，所(suǒ)以(yǐ)需(xū)要配製成2X的工作液(yè)。推(tuī)薦(jiàn)的EdU終濃度為(wéi)10μM (1X)，用(yòng)細胞培養液1:500稀(xī)釋(shì)EdU (10mM)即(jí)可得到(dào)2X的(dí)EdU工作液(yè)(20μM)。
注(zhù)意(yì)：對(duì)於A549，HeLa和NIH/3T3等貼(tiē)壁細胞，推薦(jiàn)EdU的使(shǐ)用(yòng)終濃(nóng)度(dù)為(wéi)10μM。但細(xì)胞(bāo)類型(xíng)，培(péi)養(yǎng)液種類(lèi)，細胞密度(dù)，細胞增殖速度(dù)等多方麵的(dí)因素會影(yǐng)響(xiǎng)EdU摻(chān)入(rù)到(dào)細胞(bāo)中(zhōng)的(dí)量，因(yīn)此(cǐ)初(chū)次使(shǐ)用時建(jiàn)議對(duì)EdU的(dí)使用(yòng)濃度進行一(yī)定的摸索(suǒ)。如(rú)果(guǒ)之(zhī)前(qián)使(shǐ)用(yòng)過BrdU進行實(shí)驗，則(zé)可(kě)以參考BrdU的(dí)終(zhōng)濃(nóng)度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作(zuò)液(20μM)，等(děng)體(tǐ)積(jī)加入6孔板(bǎn)中(zhōng)，使6孔(kǒng)板(bǎn)中的(dí)EdU終濃(nóng)度(dù)變為(wéi)1X。例如(rú)設計終濃度(dù)為10μM，原先6孔(kǒng)板中(zhōng)的培養基為(wéi)1ml，則將(jiāng)1ml 2X的EdU工(gōng)作(zuò)液(20μM)加入到孔(kǒng)板中。如果培養(yǎng)基體積(jī)過大(dà)，可以先吸(xī)除適(shì)量的(dí)培養(yǎng)液，再(zài)加入等體(tǐ)積的2X的EdU工作液(yè)；或(huò)者(zhě)可以減(jiǎn)少工作液(yè)的體積並增加EdU的(dí)濃度(dù)，使(shǐ)最終(zhōng)培養(yǎng)液中的EdU濃度(dù)為10μM，例如2ml培養液(yè)中加入(rù)220微升(shēng)0.1mM EdU。更換(huàn)所有的培養液可(kě)能(néng)會對細(xì)胞(bāo)的增(zēng)殖(zhí)有影響(xiǎng)，因此(cǐ)不(bù)建議替換(huàn)所(suǒ)有(yǒu)的培養液。
d.繼(jì)續孵(fū)育細(xì)胞2小(xiǎo)時。該(gāi)孵(fū)育(yù)時間的(dí)長短取(qǔ)決(jué)於細胞生長(cháng)速率，通(tōng)常宜繼(jì)續(xù)孵(fū)育(yù)細胞周期10%左(zuǒ)右的時間。對於(yú)常見(jiàn)的哺(bǔ)乳動(dòng)物細(xì)胞如(rú)HeLa，3T3，HEK293等(děng)，細(xì)胞(bāo)周期大(dà)約在18-25小(xiǎo)時(shí)，孵育時間宜(yí)在(zài)2小時左(zuǒ)右。人胚胎細胞的細(xì)胞周期約30分(fēn)鐘(zhōng)，推(tuī)薦的(dí)孵育時間為(wéi)5分(fēn)鐘；酵(jiào)母細(xì)胞的細胞周(zhōu)期(qī)約3小(xiǎo)時，推薦的(dí)孵(fū)育(yù)時間為20分鐘，增(zēng)殖的神經細胞其(qí)細(xì)胞(bāo)周(zhōu)期約(yuē)5天，推薦的孵育時間為(wéi)1天(tiān)。孵育時間(jiān)小(xiǎo)於(yú)45分(fēn)鐘(zhōng)時(shí)，建議提高EdU的(dí)濃(nóng)度；孵育時間大於(yú)20小(xiǎo)時時(shí)，建(jiàn)議適當降低(dī)EdU的(dí)濃(nóng)度。
e.EdU標(biāo)記(jì)細胞完(wán)成後(hòu)，去除培(péi)養液，並加入1ml固定液(可以使用碧(bì)雲(yún)天(tiān)的免疫(yì)染色固(gù)定液(yè)P0098，或(huò)4%的多聚甲醛P0099)，室溫(wēn)固(gù)定(dìng)15分鐘(zhōng)。注：對(duì)於流(liú)式細胞(bāo)儀(yí)檢(jiǎn)測(cè)，貼壁細(xì)胞胰(yí)酶消化(huà)後用培養(yǎng)液重懸(xuán)後(hòu)再(zài)固定。
f.去除固(gù)定液(yè)，每(měi)孔(kǒng)用(yòng)1ml洗滌(dí)液洗滌細胞(bāo)3次，每次(cì)3-5分(fēn)鐘。
g.去除(chú)洗(xǐ)滌液，每孔(kǒng)用1ml通透液(可以(yǐ)使用碧(bì)雲天的(dí)免(miǎn)疫染色(sè)強力通透(tòu)液P0097，免疫染色(sè)洗滌(dí)液P0106，或含(hán)0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育(yù)10-15分鐘(zhōng)。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌(dí)液(yè)洗滌(dí)細(xì)胞1-2次，每(měi)次(cì)3-5分鐘。
i.轉(zhuǎn)步驟5。
4.動物體(tǐ)內EdU的標記及(jí)切片(piàn)樣(yàng)品的(dí)處(chǔ)理
EdU可以(yǐ)通過(guò)注射或(huò)進食(shí)等適(shì)當方式進行動(dòng)物的體內標記。如下以小(xiǎo)鼠為例(lì)，其(qí)它(tā)動(dòng)物(wù)體內(nèi)EdU的標記請(qǐng)參考相(xiāng)關(guān)文獻。
a.對於小鼠，可以(yǐ)按(àn)照(zhào)10-200mg/kg的用量(liáng)，把EdU用PBS配製成(chéng)一定濃(nóng)度，腹腔注(zhù)射，特(tè)定組(zǔ)織或(huò)器官局部(bù)注(zhù)射(shè)或(huò)者(zhě)加入飲用(yòng)水(shuǐ)中。具體(tǐ)用量跟(gēn)所用(yòng)動(dòng)物(wù)的種類，體重和使(shǐ)用方式有關(guān)，可(kě)以(yǐ)參(cān)考(kǎo)相關(guān)文(wén)獻，因此初次(cì)使用(yòng)時建議對EdU的使用(yòng)濃(nóng)度進(jìn)行一(yī)定的摸(mō)索，或(huò)者直接使(shǐ)用50mg/kg的(dí)濃度(dù)進行測試(shì)。如果之前使用(yòng)過(guò)BrdU進行實驗(yàn)，則可以(yǐ)參考BrdU的(dí)終濃(nóng)度(dù)作(zuò)為(wéi)EdU的終濃(nóng)度(dù)。EdU可(kě)以(yǐ)單獨購買(mǎi)碧(bì)雲天(tiān)的ST067。
b.4小(xiǎo)時後(hòu)或根(gēn)據(jù)特定(dìng)實驗確定(dìng)的適當時(shí)間後，快速處(chǔ)死小(xiǎo)鼠，取出(chū)所需的(dí)組(zǔ)織，按照常規步驟製(zhì)作冰(bīng)凍切片或石蠟(là)切片。EdU標(biāo)記的(dí)時間(jiān)也可以參(cān)考相關(guān)文(wén)獻自行(háng)調(tiáo)整(zhěng)。
c.對於冰凍(dòng)切(qiē)片：
(a)加入適(shì)量(liáng)固(gù)定(dìng)液(yè)(可以(yǐ)使(shǐ)用碧雲天的免(miǎn)疫染色固(gù)定液P0098，或4%的多聚甲(jiǎ)醛P0099)，室溫固(gù)定15分鐘。
(b)去除(chú)固定液(yè)，用(yòng)適量洗滌液洗滌3次，每次(cì)3-5分(fēn)鐘。
(c)去(qù)除洗(xǐ)滌液(yè)，用(yòng)適(shì)量通透液(可以(yǐ)使用(yòng)碧(bì)雲(yún)天的免疫(yì)染色強力通透液P0097，免疫染色(sè)洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫(wēn)孵(fū)育(yù)10-15分(fēn)鐘。
(d)去除通透液(yè)，用(yòng)適(shì)量(liáng)洗(xǐ)滌液(yè)洗滌1-2次(cì)，每次(cì)3-5分(fēn)鐘。
(e)抗(kàng)原(yuán)修復(fù)(選做)：如(rú)果(guǒ)同時(shí)需(xū)要(yào)進(jìn)行目的蛋(dàn)白的免疫熒光染色(sè)，並(bìng)有(yǒu)必要進(jìn)行抗(kàng)原(yuán)修復，可(kě)以(yǐ)使用適當的抗原(yuán)修(xiū)復(fù)液，例如(rú)P0090冰(bīng)凍切片(piàn)快速抗(kàng)原(yuán)修復液(yè)(5X)，或(huò)者自行(háng)配(pèi)製的適當(dāng)的抗原修復液進行抗原(yuán)修(xiū)復處理。
(f)轉步驟(zhòu)5。
d.對於石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中(zhōng)脫(tuō)蠟5-10分鐘。換用(yòng)新鮮(xiān)的二(èr)甲(jiǎ)苯，再(zài)脫蠟5-10分鐘。無水(shuǐ)乙(yǐ)醇5分鐘，換新的無水(shuǐ)乙醇3分鐘。95%乙(yǐ)醇3分(fēn)鐘。85%乙醇(chún)3分(fēn)鐘。75%乙(yǐ)醇3分鐘(zhōng)。50%乙(yǐ)醇(chún)3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗(kàng)原(yuán)修復(選(xuǎn)做)：如(rú)果(guǒ)同(tóng)時需(xū)要進行目的蛋(dàn)白的免(miǎn)疫組化(huà)染(rǎn)色，可(kě)以(yǐ)使用適(shì)當(dāng)的抗原修(xiū)復液，例如(rú)P0081檸(níng)檬酸(suān)鈉(nà)抗(kàng)原修(xiū)復(fù)液(50X)，P0083改(gǎi)進型檸(níng)檬(méng)酸(suān)鈉(nà)抗原(yuán)修復液(yè)(50X)，P0085 EDTA抗(kàng)原(yuán)修復液(yè)(50X)，P0086檸檬酸鈉(nà)-EDTA抗(kàng)原(yuán)修(xiū)復(fù)液(40X)，P0088通(tōng)用型強(qiáng)力(lì)抗原修(xiū)復(fù)液(10X)，P0092漂(piāo)片抗原修復液(10X)，或者(zhě)自(zì)行(háng)配製適(shì)當的(dí)抗原修復(fù)液進(jìn)行(háng)抗原(yuán)修(xiū)復處(chǔ)理。
特別注(zhù)意(yì)：如果(guǒ)使用蛋白酶K或(huò)胰酶進行抗原(yuán)修(xiū)復，必須(xū)反(fǎn)復(fù)洗滌幹淨(jìng)，否則殘留的酶會嚴重幹(gān)擾(rǎo)後續標記反(fǎn)應。
(c)轉步(bù)驟(zhòu)5。
5.EdU檢(jiǎn)測(cè)
注意：本步(bù)驟(zhòu)六孔(kǒng)板中(zhōng)每(měi)孔的(dí)反(fǎn)應體係為(wéi)500μl的反應混合物。對於(yú)12，24，48，96和(hé)384孔板(bǎn)，每(měi)孔的(dí)反應的體係分(fēn)別為200μl，100μl，70μl，50μl和(hé)20μl的反(fǎn)應混(hùn)合物。對(duì)於較小的孔，單位培養麵(miàn)積的液體(tǐ)用量(liáng)已經適當增加，以有效避免(miǎn)液體蒸發可能帶(dài)來的(dí)負(fù)麵影(yǐng)響(xiǎng)。對(duì)於切(qiē)片，可(kě)以(yǐ)根據(jù)切片(piàn)大小，每個(gè)切片使(shǐ)用100-200μl的反(fǎn)應混(hùn)合物(wù)。如下以六孔板中的(dí)細胞(bāo)樣(yàng)品為例(lì)說(shuō)明具(jù)體的(dí)操作(zuò)方(fāng)法，對(duì)於其(qí)它孔板或切片(piàn)，僅(jǐn)每步溶(róng)液的用量(liáng)按(àn)比例調(tiáo)整(zhěng)即可(kě)，其(qí)餘(yú)方(fāng)法(fǎ)相同。
a.配(pèi)製(zhì)Click Additive Solution：對於C0071S，用1.3ml去離子水溶(róng)解一管Click Additive，混匀至全(quán)部溶解(jiě)，即為Click Additive Solution；對(duì)於(yú)C0071L，加(jiā)入(rù)10.4ml去離(lí)子(zǐ)水溶(róng)解(jiě)試劑盒(hé)中提供的一瓶Click Additive，混匀至(zhì)全(quán)部(bù)溶解(jiě)，即為Click Additive Solution。配製後(hòu)可(kě)以(yǐ)適(shì)當分裝，並-20℃保存(cún)。
b.參(cān)考(kǎo)下表配製(zhì)Click反應(yīng)液(yè)。注意：請嚴格按(àn)照(zhào)下表(biǎo)中(zhōng)組分順序和(hé)體積(jī)配製Click反應(yīng)液(yè)，否(fǒu)則(zé)點擊反應(yīng)可(kě)能無(wú)法(fǎ)有(yǒu)效(xiào)進(jìn)行；同時，Click反應液須在配製(zhì)後(hòu)15分鐘(zhōng)內使(shǐ)用(yòng)。

c.去除(chú)上(shàng)一步(bù)驟(zhòu)中的洗滌液。
d.每孔加(jiā)入0.5ml Click反應液，輕(qīng)輕搖晃(huǎng)培(péi)養(yǎng)板(bǎn)以確保(bǎo)反(fǎn)應(yīng)混合(hé)物可(kě)以均(jūn)匀覆(fù)蓋樣品(pǐn)。
e.室(shì)溫避光孵育(yù)30分(fēn)鐘。
f.吸除(chú)Click反應(yīng)液，用(yòng)洗滌液(yè)洗滌(dí)3次，每次3-5分鐘(zhōng)。
g.如果需(xū)要對(duì)細胞(bāo)核進行染(rǎn)色，可(kě)以參照步驟(zhòu)6進行。如(rú)無(wú)其它(tā)的(dí)特殊(shū)需(xū)要，即(jí)可(kě)在(zài)熒光顯(xiǎn)微鏡下觀(guān)察，或者使用(yòng)流式細(xì)胞(bāo)儀(yí)，多功(gōng)能(néng)酶(méi)標儀進行熒(yíng)光檢(jiǎn)測，或者用(yòng)高內涵篩選儀器(一般高(gāo)內涵篩(shāi)選(xuǎn)需要使用染(rǎn)料(liào)對細胞核(hé)進行染色)進(jìn)行檢測。Azide 488的最大(dà)激(jī)發(fā)波長是(shì)495nm，最(zuì)大(dà)發射(shè)波(bō)長是(shì)519nm。
6.細(xì)胞核染色(sè)
為(wéi)了(liǎo)檢測細(xì)胞增殖(zhí)的比例(lì)，可(kě)以(yǐ)考(kǎo)慮(lǜ)使用(yòng)Hoechst 33342進行細(xì)胞核染(rǎn)色。一般高內涵篩(shāi)選儀器(qì)也(yě)需要(yào)對細胞(bāo)核進(jìn)行染色(sè)。
a.1X Hoechst 33342溶(róng)液的配(pèi)製(zhì)：按(àn)1:1000比例(lì)用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接(jiē)上述步(bù)驟5g，吸(xī)除(chú)洗滌液(yè)後，每(měi)孔加1X Hoechst 33342溶液(yè)1ml，室溫避(bì)光孵(fū)育(yù)10分鐘(zhōng)。
c.吸除(chú)1X Hoechst 33342溶液(yè)。
d.用洗(xǐ)滌液(yè)洗(xǐ)滌3次(cì)，每(měi)次(cì)3-5分鐘。
e.隨後即可(kě)進行(háng)熒光檢(jiǎn)測。Hoechst 33342為藍色熒(yíng)光(guāng)，最大(dà)激發波長為346nm，最大(dà)發(fā)射(shè)波(bō)長(cháng)為(wéi)460nm。
7.流式細胞(bāo)儀(yí)檢(jiǎn)測
對於經步驟(zhòu)5或6獲得(dé)的細(xì)胞(bāo)懸(xuán)液(yè)樣(yàng)品(pǐn)進(jìn)行流式檢測。如果使(shǐ)用傳統的流體動力(lì)學聚焦(jiāo)的流式細胞儀來測量(liáng)總(zǒng)DNA含量，請(qǐng)在檢(jiǎn)測過程(chéng)中使用(yòng)低(dī)流速(sù)，實(shí)驗中的每個樣(yàng)品(pǐn)應(yīng)使用(yòng)相(xiāng)同的收集(jí)速率和細胞(bāo)濃(nóng)度。EdU標記產生的熒光信(xìn)號(hào)一(yī)般使用(yòng)對數(shù)刻(kè)度的橫(héng)坐標(biāo)(如(rú)圖4中的(dí)橫(héng)坐標)。Azide 488的(dí)最(zuì)大激(jī)發波長是495nm，最大發射波長是519nm。
注1：建議(yì)使(shǐ)用(yòng)未經(jīng)EdU標記的(dí)細胞(bāo)樣(yàng)品作(zuò)為(wéi)流(liú)式細(xì)胞(bāo)儀檢測的陰性(xìng)對(duì)照，並(bìng)選(xuǎn)擇合適的電(diàn)壓。
注2：由(yóu)於流式細(xì)胞(bāo)儀(yí)檢(jiǎn)測比(bǐ)較(jiào)靈(líng)敏，可(kě)根(gēn)據細胞(bāo)類型(xíng)和實(shí)際染色情況對Azide 488的使用量進行適當調整。
相(xiāng)關產(chǎn)品：