WB（WesternBlot）是一(yī)種常用(yòng)的(dí)生物(wù)化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術，用(yòng)於檢測和(hé)分析蛋白(bái)樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)特定(dìng)蛋白(bái)質(zhì)的存在(zài)和表達水平。它(tā)通過(guò)將樣(yàng)品中(zhōng)的蛋(dàn)白(bái)質(zhì)分離並轉(zhuǎn)移(yí)到(dào)膜上(shàng)，然(rán)後使用(yòng)特(tè)定的抗(kàng)體識(shí)別目(mù)標蛋(dàn)白(bái)，並(bìng)通(tōng)過化(huà)學(xué)或免疫檢測(cè)方法來可(kě)視化(huà)這(zhè)些蛋(dàn)白(bái)質(zhì)。WesternBlot技(jì)術通常包括樣(yàng)品製備，SDS-PAGE電泳(yǒng)分(fēn)離，蛋白(bái)轉印，封(fēng)閉(bì)和抗體檢(jiǎn)測，曝光顯影等步(bù)驟。目前WB被(bèi)廣泛應用於生物醫學(xué)研(yán)究中，用於(yú)研究蛋(dàn)白質表達(dá)，翻譯後修(xiū)飾(shì)以及蛋白(bái)質相互作用等(děng)。

圖(tú)1.WB流程(chéng)圖(tú)

在日常(cháng)實驗(yàn)過程(chéng)中，小分(fēn)子(zǐ)蛋白(bái)是非(fēi)常常見的(dí)，小(xiǎo)分子(zǐ)蛋(dàn)白是指待檢測(cè)的蛋白(bái)分子量小於20kda，常(cháng)見的(dí)凋亡(wáng)蛋白如(rú)Bcl2，Caspase-3，Bax，自噬(shì)相關蛋(dàn)白(bái)如LC3B等均為(wéi)小分子(zǐ)蛋(dàn)白，這類蛋(dàn)白由於(yú)較小的分(fēn)子量，易受到凝(níng)膠網孔的影(yǐng)響在電泳過程中彌(mí)散，導(dǎo)致(zhì)難(nán)以分離(lí)和檢(jiǎn)測(cè)。因(yīn)此，為了檢(jiǎn)測到(dào)小(xiǎo)分子量的蛋(dàn)白，需要對實(shí)驗(yàn)步驟(zhòu)進行(háng)一些(xiē)優化，以提(tí)高實(shí)驗成(chéng)功率(shuài)。

1. 配(pèi)膠(jiāo)：整體(tǐ)配膠遵(zūn)循蛋白分(fēn)子量越小膠(jiāo)濃度越大(dà)的(dí)原則，對(duì)於(yú)小(xiǎo)分(fēn)子蛋白(bái)來說，分(fēn)離膠濃度一(yī)般為(wéi)12%-15%，對(duì)於(yú)小分子蛋(dàn)白條(tiáo)帶可(kě)以分的更(gēng)加(jiā)清(qīng)晰(xī)。同時在倒(dǎo)膠(jiāo)時(shí)濃縮(suō)膠的(dí)比例(lì)可以(yǐ)適(shì)當增加到4：6，使其充分濃縮，後續電(diàn)泳過程中一(yī)定(dìng)程(chéng)度上可(kě)以(yǐ)減少彌散(sàn)。15-20kda可選(xuǎn)擇(zé)12%的凝(níng)膠(jiāo)
；10-15kda可(kě)選(xuǎn)擇(zé)13.5%的凝(níng)膠
；小於10kda的蛋白用(yòng)15%的凝(níng)膠或者用Tricine-SDS-PAGE凝膠(jiāo)電(diàn)泳體係(xì)。與傳(chuán)統的Gly-SDS-PAGE相比(bǐ)，Tricine-SDS-PAGE使(shǐ)用(yòng)三羥甲基氨基(jī)甘(gān)氨(ān)酸（Tricine）代(dài)替(tì)甘氨(ān)酸（Gly），具(jù)有更(gēng)好(hǎo)的小分(fēn)子(zǐ)蛋(dàn)白分離效(xiào)果。

2. 上樣(yàng)：根據(jù)日常上樣(yàng)經(jīng)驗，建議在(zài)跑小分(fēn)子(zǐ)蛋(dàn)白時(shí)增(zēng)加1倍(bèi)上樣量，防止蛋(dàn)白彌散過(guò)多(duō)。選擇marker時(shí)，選擇適(shì)用(yòng)於(yú)小分子蛋(dàn)白(bái)的marker，後續敷抗體時可以更清楚(chǔ)的進(jìn)行(háng)裁(cái)膜(mó)。電(diàn)泳開始前可用1´loadingbuffer補(bǔ)齊未點樣的膠孔，防止兩邊(biān)不齊(qí)跑成“八"字。

圖1：賽(sài)默(mò)飛marker示意(yì)圖（左：常(cháng)規蛋白marker
；右：小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)蛋白marker）

3. 電泳(yǒng)：濃縮膠(jiāo)部分(fēn)設置恒(héng)壓70V，30min左(zuǒ)右(yòu)，一(yī)般即可(kě)濃(nóng)縮到一(yī)條綫上之(zhī)後(hòu)調(tiáo)大電(diàn)壓至(zhì)110V，至所需蛋白區域全(quán)部(bù)分(fēn)開為(wéi)止(zhǐ)。盡(jìn)量避免(miǎn)長時間低(dī)電壓(yā)跑膠(jiāo)，易導致(zhì)蛋白彌散過(guò)多。同時整個電泳(yǒng)過程(chéng)中(zhōng)注(zhù)意(yì)降溫(wēn)。

4. 轉膜：由(yóu)於小分(fēn)子蛋白分(fēn)子量小，吸(xī)附能(néng)力弱，因此轉(zhuǎn)膜時(shí)選(xuǎn)擇(zé)0.22μm的PVDF膜，常規0.45μm膜容(róng)易(yì)穿透，剩餘條(tiáo)件(jiàn)同正(zhèng)常蛋白一(yī)般(bān)可(kě)以滿(mǎn)足條(tiáo)件(jiàn)。

5. 封閉：快速封閉(bì)液(yè)或脫脂牛(niú)奶(nǎi)按正常條件封閉即(jí)可。裁膜時根(gēn)據marker上(shàng)下留出(chū)足(zú)夠多的(dí)空(kōng)間(jiān)。

6. 一抗孵(fū)育：在保證上述條件(jiàn)的(dí)基(jī)礎(chǔ)上，一抗是出(chū)好結果(guǒ)的(dí)關鍵(jiàn)一步(bù)，若沒前期(qī)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，一抗的稀(xī)釋(shì)比一(yī)般(bān)按(àn)照說明書配置，若有(yǒu)前期(qī)實驗的(dí)經驗，可(kě)適當進(jìn)行(háng)比例調(tiáo)整(zhěng)，一抗濃度過高最後顯(xiǎn)影階段易(yì)出現雜(zá)帶，過低(dī)則可(kě)能看不到(dào)條帶。使(shǐ)用(yòng)1´TBST緩(huǎn)衝(chōng)液稀(xī)釋(shì)，4℃孵育過夜。

7. 後(hòu)續(xù)二(èr)抗(kàng)比(bǐ)例(lì)及孵(fū)育時間，顯(xiǎn)影按(àn)常(cháng)規(guī)操(cāo)作(zuò)即(jí)可。需(xū)要(yào)注意若抗(kàng)體(tǐ)不好用或者(zhě)蛋白(bái)難(nán)出結果，在敷(fū)完一(yī)二(èr)抗(kàng)時可適當延長洗膜(mó)時(shí)間及(jí)次(cì)數。

注意事項：

1. 轉膜時(shí)，若蛋(dàn)白分子量過(guò)小，可適(shì)當(dāng)提高甲醇比(bǐ)例（30%左(zuǒ)右(yòu)）改善(shàn)吸(xī)附(fù)能(néng)力。

2. 跑小(xiǎo)分子(zǐ)蛋白(bái)時marker盡(jìn)量不跑到(dào)一(yī)張膜(mó)上，對(duì)於常(cháng)見內參(cān)GAPDH，Actin及(jí)Tubulin等來說，分(fēn)離膠(jiāo)濃(nóng)度(dù)大(dà)上述蛋(dàn)白區(qū)域(yù)一般分不開或(huò)分離不完整，易導致(zhì)內(nèi)參不齊(qí)。

天津(jīn)益(yì)元利(lì)康生物(wù)科技(jì)有限公(gōng)司：

一，輻射五大服(fú)務方(fāng)向：

  1.國內(nèi)試(shì)劑耗材經銷代(dài)理(lǐ)
；

  2.國(guó)外試(shì)劑訂購（直(zhí)訂，或(huò)境外(wài)代理(lǐ)）
；

  3.基因組測(cè)序（二代，二代+三(sān)代）
；

  4.基因(yīn)分(fēn)型(xíng)（SNP檢測）：低(dī)/中/中(zhōng) 高通量(liáng)項目
；

  5.生(shēng)物(wù)樣本運輸(shū)（國內，）
；

二，多(duō)家代理品牌，涉及(jí)30多種(zhǒng)較(jiào)有名品(pǐn)牌，經營代(dài)理500多個品牌：

Qiagen，Sigma，R&D，Epigentek，ThermoFisher，DNA Genotek，USA Scientific，Matreya，Sage Science，List Labs，Macrocyclics，Steraloids，NIBSC，mobio，immunodx，cellsystems，medicago，abcam，CST，Roche，Bethyl，sino Biological，clodrosome，adi BIO-WORLD，TOKU-E，HYPHEN BioMed，moltox，ZeptoMetrix，International Humic，biocytex，Toxin Technology  ，Streck，Elastin，biomax，Orflo Technologies，Accegen，Advbiomart，genlantis，R&D，Cygnus Technologies LLC，Enzyme Research，Bio/Data Corporation，Greer Lab ，Solarbio，bangslabs，bioline，musechem，Novocastra stemrd，hyphen-biomed，polyplus，moltox ，exiqon，pentapharm，verichemlabs，GenStar，ALZET，lucernatechnologies ，meridian，origene，zimmerpeacocktech，horizondiscovery，Reagents，megazyme，elisasystems………

  所(suǒ)有生物試劑耗材(cái)都可(kě)以(yǐ)進口，特(tè)別是(shì)冷門(mén)品(pǐn)牌，均能(néng)給客戶(hù)購買(mǎi)到。價格優(yōu)，貨(huò)期短(duǎn)，可(kě)加急，快(kuài)10天(tiān)到貨(huò)
；保證服務質量，所(suǒ)有(yǒu)產品(pǐn)均(jūn)提(tí)供(gōng)售後服務。大(dà)部分(fēn)客(kè)戶我們提(tí)供(gōng)貨到(dào)付款服務，

  公(gōng)司自(zì)成(chéng)立依(yī)靠過硬的服(fú)務和(hé)良好的信譽與(yǔ)各(gè)大企(qǐ)事(shì)業(yè)單位(wèi)，科研(yán)單位建立長(cháng)期合(hé)作。客戶(hù)包(bāo)括北(běi)大，清(qīng)華(huá)，地(dì)大，中科院各所，各大藥企(qǐ)等(děng)等。

  專(zhuān)業(yè)訂購(gòu)國內(nèi)外試劑耗(hào)材，常備(bèi)現(xiàn)貨(huò)，一(yī)手(shǒu)貨源(yuán)，歡(huān)迎(yíng)合作。