慢病毒(dú)包裝(zhuāng)實(shí)驗(yàn)

慢病毒（Lentivirus）載體是以 HIV-1 （人(rén)類免疫缺陷(xiàn) 1 型(xíng)病毒）為(wéi)基礎(chǔ)發(fā)展(zhǎn)起來的基因治(zhì)療(liáo)載(zǎi)體(tǐ)。慢(màn)病毒具有感(gǎn)染譜廣泛(fàn)，可(kě)以有效(xiào)感(gǎn)染(rǎn)分(fēn)裂期和(hé)靜止期(qī)細胞，長(cháng)期穩(wěn)定(dìng)表(biǎo)達外(wài)源基因等優(yōu)點，因(yīn)此(cǐ)成為導入外源(yuán)基因(yīn)的(dí)有力(lì)工具(jù)。現(xiàn)在慢病毒係統(tǒng)已(yǐ)經(jīng)被(bèi)廣泛(fàn)應用到各(gè)種細胞係的基因(yīn)過表達，RNA 幹擾(rǎo)，microRNA 研究(jiū)以(yǐ)及活體動物實驗中(zhōng)。

一，實驗(yàn)流程(chéng)

圖(tú)  1， 慢病(bìng)毒包(bāo)裝實驗(yàn)流程圖(tú)

二(èr)，實驗儀(yí)器與實驗(yàn)材料

psPAX2 質(zhì)粒，pMD2.G 質(zhì)粒，pHBLVTM 係列(liè)質(zhì)粒(lì)
；293T 細胞(bāo)
；wan全培養基
；DH5α 菌(jūn)株(zhū)
；Stbl3 菌株(zhū)。

三(sān)，實驗(yàn)步(bù)驟

1. 質(zhì)粒擴增。將(jiāng)構建好的(dí)慢病(bìng)毒(dú)載體(tǐ)和(hé)包(bāo)裝質粒(lì)使(shǐ)用(yòng)大(dà)抽(chōu)試劑盒進行質(zhì)粒的(dí)去(qù)內毒(dú)素抽提，濃(nóng)度建議不低於 1 μg/μl，A260/280 在(zài) 1.7-1.8 間方可用(yòng)於病(bìng)毒(dú)包(bāo)裝。推薦(jiàn)使用 Qiagen 大抽試劑盒(hé)進行質粒的(dí)大(dà)量(liáng)去(qù)內(nèi)毒(dú)素抽提（質粒(lì)質(zhì)量(liáng)會極大影響(xiǎng)後續轉(zhuǎn)染效(xiào)率和(hé)病毒的(dí)滴度）。

2. 脂質體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一(yī)天，在(zài)10 cm皿中(zhōng)接種生(shēng)長(cháng)狀態良好的(dí)293T細胞(bāo)，以(yǐ)第二天(tiān)匯合度能達到 30% ~ 50% 為宜。24 h 後(hòu)轉(zhuǎn)染(rǎn)，轉染(rǎn)前需要把(bǎ) DMEM 和慢病毒包(bāo)裝專用轉染(rǎn)試劑(jì) LentiFitTM 恢復至(zhì)室溫，使用前需搖(yáo)匀。每(měi)個皿(mǐn)的質(zhì)粒成分(fēn)如(rú)下(xià)：

表(biǎo) 1，慢病毒(dú)包裝(zhuāng)轉染(rǎn)體係

用於(yú)包裝的三(sān)個(gè)質粒(lì)摩爾(ěr)比通常(cháng)為(wéi) 1:1:1，可(kě)以根(gēn)據情況(kuàng)稍加調(tiáo)整。請(qǐng)參考 LentiFitTM 轉染試(shì)劑說明(míng)書(shū)進(jìn)行(háng)轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染(rǎn)後 4-6 h 換(huàn)新鮮培(péi)養(yǎng)基。

3. 病毒(dú)收集和離(lí)心。轉(zhuǎn)染(rǎn)後 48 h 和(hé) 72 h 分別兩次(cì)收集(jí)病(bìng)毒上(shàng)清（48 h 收集後置換新鮮培液(yè)）， 將收(shōu)集(jí)的(dí)上(shàng)清(qīng)用 0.45 μm 濾器過濾(lǜ)，然後放於超速離心管中，4 ℃，72000 g 離心 120 min。

4. 病(bìng)毒重懸和保存。棄上(shàng)清，500 μl 重(zhòng)懸(xuán)液(yè)重懸(xuán)病(bìng)毒(dú)沉澱，一周內(nèi)使(shǐ)用則置於 4 ℃ 保(bǎo)存(cún)，如需(xū)長(cháng)時(shí)間(jiān)存放需置(zhì)於 -80 ℃ 或液(yè)氮罐(guàn)保(bǎo)存。（注：具(jù)體(tǐ)重懸(xuán)體積根據實驗需求(qiú)而定）

5. 滴(dī)度測(cè)定。在 96 孔板(bǎn)中(zhōng)鋪合適(shì)數量的(dí) 293T 細胞(bāo)，第(dì)二天(tiān)將(jiāng)慢(màn)病(bìng)毒(dú)原(yuán)液進行(háng)梯度(dù)稀釋後分別(bié)感染 293T 細(xì)胞(bāo)，感(gǎn)染 24 h 後換成(chéng)無病毒(dú)的培養液，感(gǎn)染 72 h 後在熒(yíng)光顯微鏡(jìng)下觀(guān)察結(jié)果，對熒光(guāng)比(bǐ)例(lì)合適（10 ~ 30% 之(zhī)間(jiān)）的孔進行細胞計數(shù)。

滴度計(jì)算公式為：滴度(dù)（TU/ml）=細胞數(shù) ×熒(yíng)光百分比×10 3 / 病毒(dú)原液體(tǐ)積

四(sì)，注意(yì)事項

1. 慢病(bìng)毒(dú)相關實驗(yàn)請在(zài)生物(wù)安全櫃(guì)（BL-2 級(jí)別(bié)）內(nèi)操作(zuò)。

2. 操(cāo)作病(bìng)毒時(shí)請(qǐng)穿(chuān)實驗服(fú)，佩(pèi)戴口(kǒu)罩和手(shǒu)套，盡量不(bù)要裸露(lòu)雙手(shǒu)及手(shǒu)臂的皮(pí)膚。

3. 操作病毒時特(tè)別小(xiǎo)心(xīn)病毒濺(jiàn)出(chū)。如果操作時超淨工作台有(yǒu)bing毒汙染，請立即用(yòng) 70% 乙醇加(jiā) 1% 的 SDS 溶(róng)液擦拭(shì)幹淨(jìng)。接(jiē)觸過病(bìng)毒的(dí)槍頭(tóu)，離心管，培(péi)養板，培養液請(qǐng)於 84 消(xiāo)毒(dú)液(yè)浸泡後統一處(chǔ)理。

4. 如需要(yào)離心，應使(shǐ)用密(mì)封(fēng)性(xìng)好(hǎo)的離(lí)心管(guǎn)， 如有必要請用封(fēng)口膜封(fēng)口(kǒu)後(hòu)離心。

5. 病毒相關(guān)的廢(fèi)棄物(wù)需(xū)要(yào)特殊收(shōu)集，統(tǒng)一(yī)經高溫滅(miè)菌(jūn)處(chǔ)理(lǐ)。

6. 實(shí)驗完畢(bì)用(yòng)香皂(zào)清洗(xǐ)雙手(shǒu)。

五，常見(jiàn)問題

1. 影響慢病(bìng)毒出(chū)毒及滴度(dù)的原因(yīn)有(yǒu)哪些？

（1）質(zhì)粒。包(bāo)毒前需(xū)要(yào)對(duì)包(bāo)裝及表達質粒進行去內(nèi)毒素處(chǔ)理，濃(nóng)度建議不低於 1μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 間
；

（2）轉(zhuǎn)染試劑(jì)和(hé)質粒比例。要(yào)用(yòng)轉染效(xiào)率高，細(xì)胞毒(dú)性小(xiǎo)的轉染試(shì)劑，轉(zhuǎn)染(rǎn)時質(zhì)粒間(jiān)比例(lì)得當，建(jiàn)議三(sān)質粒(lì)包裝係統質粒(lì)轉染(rǎn)時(shí)的摩爾(ěr)比為 1:1:1 可根(gēn)據(jù)目(mù)的基因大(dà)小進行調整(zhěng)
；

（3）目的(dí)基(jī)因。一般(bān)慢(màn)病毒(dú)包(bāo)裝(zhuāng)的目(mù)的(dí)片(piàn)段大(dà)小在(zài) 3 k 以內(nèi)較為合適，大於(yú) 3 k 會降(jiàng)低滴度(dù)或超(chāo)過載(zǎi)體容量無法包(bāo)裝，目的(dí)基因本身是否具有毒性也會影響(xiǎng)慢(màn)病毒(dú)的出(chū)毒(dú)效(xiào)率(shuài)
；

（4）包(bāo)裝(zhuāng)細胞 -293T 細胞的(dí)狀態(tài)。細胞出(chū)毒過程中(zhōng)的細胞(bāo)活(huó)力(lì)是包裝成(chéng)功(gōng)及(jí)病毒滴(dī)度(dù)高(gāo)低的一個重(zhòng)要環(huán)節，進行包(bāo)裝轉(zhuǎn)染(rǎn) 293T 細胞前一定(dìng)要重(zhòng)視細(xì)胞是否幹淨，飽滿(mǎn)立(lì)體(tǐ)感(gǎn)是否好，鋪板是(shì)否均(jūn)匀(yún)，細胞密度在 50-60% 時(shí)進行包裝比(bǐ)較(jiào)合(hé)適
；

（5）病毒收集：在 24，48 h 觀(guān)察(chá)細胞及熒(yíng)光(guāng)狀態，判(pàn)斷是(shì)否正常(cháng)，轉染(rǎn)後 48 h 和 72 h 分(fēn)別(bié)兩次(cì)收集病(bìng)毒上清（48 h 收(shōu)集後置換(huàn)新(xīn)鮮培液）。

2. 該如何(hé)選擇(zé)合適(shì)的慢病(bìng)毒包裝質粒？

慢(màn)病毒(dú)常(cháng)用(yòng)的(dí)包裝(zhuāng)係統是二代三質粒(lì)係統(tǒng)，骨架質粒 pSPAX2 和包(bāo)膜質(zhì)粒 pMD2.G 是明確的包(bāo)裝質粒。目(mù)的基因(yīn)的表(biǎo)達(dá)質(zhì)粒需要根據實(shí)驗(yàn)需求(qiú)進(jìn)行選(xuǎn)擇，主(zhǔ)要(yào)包括(kuò)啟(qǐ)動子，標簽蛋白(bái)，熒(yíng)光和抗(kàng)性(xìng)等(děng)元(yuán)件(jiàn)。

（1）目(mù)的(dí)基因(yīn)的過表(biǎo)達通常(cháng)選擇 CMV/EF1a 啟(qǐ)動子，目的基因的(dí)幹擾(rǎo)通常(cháng)選擇(zé)U6 啟動子(zǐ)
；

（2）若需要穩(wěn)轉株(zhū)篩(shāi)選，則(zé)需(xū)攜(xié)帶(dài) PURO/BSD/NEO 等抗性(xìng)篩(shāi)選(xuǎn)基(jī)因(yīn)
；

（3）後續需(xū)要(yào)觀(guān)察慢(màn)病毒(dú)感(gǎn)染效(xiào)率一般需(xū)要(yào)攜帶 EGFP/mCherry 等熒光蛋白便(biàn)於(yú)通(tōng)過顯微(wēi)鏡直觀(guān)監(jiān)測感(gǎn)染效率
；

（4）標(biāo)簽蛋白的選(xuǎn)擇(zé)可以根據不(bù)同的(dí)實(shí)驗(yàn)需(xū)求(qiú)進行(háng)選擇，如(rú)純化(huà)蛋白(bái)常(cháng)使用(yòng) His 標(biāo)簽，CO-IP 常使(shǐ)用 Flag/HA/Myc 標簽，PULLDOWN 常使(shǐ)用 GST 標(biāo)簽(qiān)等(děng)。