腺病毒(dú)包裝實驗(yàn)

重(zhòng)組(zǔ)腺病(bìng)毒(dú)載體是(shì)基(jī)於(yú)人(rén)腺病毒 5 型（Ad5），其基(jī)因(yīn)組是(shì) 36kb 長(cháng)的(dí)綫(xiàn)性(xìng)雙(shuāng)鏈 DNA，是一(yī)種復製(zhì)缺(quē)陷型(xíng)腺病(bìng)毒(dú)載(zǎi)體(tǐ)係統(tǒng)。具有(yǒu)以下幾個顯著(zhù)優點：感(gǎn)染範圍廣(guǎng)，幾乎可以感染所(suǒ)有的細胞(bāo)係(xì)，原代(dài)細(xì)胞和部分組織；感染(rǎn)效(xiào)率可高(gāo)達(dá) 100%；對外源基因(yīn)容(róng)載能(néng)力大（可以(yǐ)高(gāo)達(dá) 8Kb）；不整合(hé)基因組；滴(dī)度高(gāo)，操(cāo)作方便。因(yīn)此，重組腺(xiàn)病毒(dú)是一(yī)種最(zuì)ju有(yǒu)潛力的基因遞(dì)送(sòng)工具。

最(zuì)chang用(yòng)的(dí)腺(xiàn)病毒包裝體係(xì)有 AdEasy 和 AdMAX 兩(liǎng)種，其共同(tóng)特(tè)點(diǎn)是目的基因(yīn)首(shǒu)先(xiān)克隆到穿梭(suō)載體(tǐ)，再(zài)重組到腺(xiàn)病毒(dú)的大骨(gǔ)架(jià)上。以(yǐ)上兩個(gè)係(xì)統均具有腺病毒(dú)早期轉錄復製基(jī)因 E1 和(hé) E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其(qí)中 E3 基因對病毒(dú)的(dí)產(chǎn)生並(bìng)非(fēi)必(bì)需。因此，腺(xiàn)病毒(dú)包裝必(bì)需依(yī)賴表達(dá) E1 的(dí)細胞係，例(lì)如 HEK-293，HEK-293A 等(děng)。

一，實驗流程

圖 1， 腺病(bìng)毒包裝實驗流(liú)程圖

二(èr)，實(shí)驗儀器與材料

表(biǎo) 1，腺病毒包裝(zhuāng)係統質粒

三，實(shí)驗步(bù)驟 

1. 質粒構建(jiàn)和擴增

AdMAX 係(xì)統：構建連接目的基因的(dí) pHBAdMAX質(zhì)粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 質粒並(bìng)大(dà)量(liáng)抽提(tí)，用於(yú)轉(zhuǎn)染(rǎn) 293A 細(xì)胞(bāo)。

AdEasy 係(xì)統：構(gòu)建連接目的(dí)基(jī)因的(dí) pHBAdEasy 質(zhì)粒並進行(háng)酶(méi)切綫性(xìng)化；綫性化(huà)後(hòu)轉入 BJ5183 感(gǎn)受(shòu)態（含 pAdEasy-1 骨架質粒）進行(háng)重(zhòng)組(zǔ)，塗板(bǎn)培養(yǎng)單(dān)克(kè)隆並(bìng)擴增，抽提(tí)質粒進(jìn)行(háng) PacI 酶(méi)切(qiē)驗證(zhèng)；驗證(zhèng)正確(què)的重組質粒(lì)轉化 Stbl3 感受(shòu)態，得到(dào)高純度(dù)的重組質粒並進行 PacI 酶切綫性化(huà)，用於(yú)轉(zhuǎn)染 293A 細胞。

2. 腺病毒(dú)包(bāo)裝

表 2，腺(xiàn)病(bìng)毒(dú)包裝(zhuāng)轉染體係(xì)

3. 腺(xiàn)病毒(dú)收集(jí)

挑(tiāo)取(qǔ) 3-6 個(gè)空斑不等，放(fàng)入(rù)1 ml新(xīn)鮮培養(yǎng)基中(zhōng)過夜，然後比較滴度，使用滴度(dù)最(zuì)高的(dí)一個(gè)空(kōng)斑進(jìn)行(háng)後(hòu)續(xù)實驗。（注(zhù)：病(bìng)毒(dú)收集(jí)前(qián)要觀(guān)察病毒空(kōng)斑(bān)是(shì)否(fǒu)形(xíng)成。為(wéi)了(liǎo)限製病毒(dú)的擴(kuò)散而讓空斑更好地(dì)形(xíng)成，可在培養液中加入低熔(róng)點瓊脂糖，一般在(zài)轉(zhuǎn)染後第 10 ~ 21 天可以在(zài)顯微鏡下看(kàn)到小(xiǎo)的空(kōng)斑(bān)。）

4. 腺(xiàn)病毒(dú)擴(kuò)增

將(jiāng)培(péi)養基中的病毒加入(rù)新鮮 293A 細胞培(péi)養(yǎng)液(yè)中(zhōng)進(jìn)行病毒(dú)少(shǎo)量(liáng)擴增(zēng)，至(zhì)再(zài)次出(chū)現空斑，收集(jí)細胞及(jí)上清(qīng)，反(fǎn)復凍融(róng)三(sān)次(cì)收(shōu)集(jí)病毒（P1 代），感(gǎn)染(rǎn) 293A 細胞(bāo)，連續(xù)進(jìn)行三代感染(rǎn)，至(zhì) P4 代進行(háng)腺病毒的(dí)大(dà)量(liáng)擴增(zēng)並收集(jí)病毒。

5. 腺病毒純化(huà)

將病(bìng)毒從 -80 ℃ 冰箱(xiāng)取出(chū)，室溫水浴(yù)融(róng)化(huà)。在 4 ℃ 下，7000 g 離(lí)心(xīn) 10 min，棄細(xì)胞碎(suì)片(piàn)，收(shōu)集上(shàng)清，0.22 μm 過濾除菌(jūn)即(jí)可用於細(xì)胞(bāo)實驗。若用於(yú)對腺(xiàn)病(bìng)毒(dú)滴(dī)度和純度要求(qiú)高的動物(wù)實驗，則需要采用(yòng) PEG8000 沉(chén)澱-CsCl 密度梯(tī)度離(lí)心-透(tòu)析(xī)聯用(yòng)法(fǎ)進行(háng)純化。

6. 病毒(dú)重懸和保存

棄上清(qīng)，500 μl 重(zhòng)懸(xuán)液(yè)重(zhòng)懸病毒沉(chén)澱(diàn)，一周內(nèi)使(shǐ)用(yòng)則(zé)置(zhì)於(yú) 4 ℃ 保存(cún)，如(rú)需(xū)長(cháng)時(shí)間存放(fàng)需(xū)置(zhì)於 -80 ℃ 或液氮(dàn)罐保存(cún)。

四，注(zhù)意事項

1. 腺病(bìng)毒相(xiāng)關實驗(yàn)請在(zài)生(shēng)物(wù)安全櫃（BL-2 級(jí)別）內(nèi)操作(zuò)。

2. 操(cāo)作(zuò)病(bìng)毒(dú)時請穿(chuān)實驗(yàn)服(fú)，佩(pèi)戴口罩和(hé)手套(tào)，盡(jìn)量(liáng)不要(yào)裸(luǒ)露雙(shuāng)手(shǒu)及手(shǒu)臂的皮(pí)膚。

3. 操(cāo)作(zuò)病(bìng)毒時特別(bié)小(xiǎo)心病毒(dú)濺出(chū)。如(rú)果(guǒ)操作時超淨工(gōng)作台有(yǒu)bing毒汙(wū)染，請(qǐng)立即用(yòng)70%乙醇加(jiā)1%的(dí)SDS溶(róng)液擦拭幹淨(jìng)。接(jiē)觸過(guò)病(bìng)毒(dú)的槍(qiāng)頭(tóu)，離(lí)心(xīn)管，培養(yǎng)板，培(péi)養(yǎng)液請用(yòng)84消毒液浸(jìn)泡後統一處理。

4. 如需要離心，應(yīng)使用(yòng)密封性好的(dí)離心(xīn)管(guǎn)，如有必(bì)要請(qǐng)用封口膜(mó)封口後離心(xīn)。

5. 動物注(zhù)射(shè)操(cāo)作(zuò)請(qǐng)在(zài)生(shēng)物(wù)安(ān)全櫃內（BL-2 級(jí)別）完成(chéng)。

6. 病毒相關的(dí)廢(fèi)棄物需要(yào)特(tè)殊(shū)收集，統一(yī)經(jīng)高(gāo)溫滅菌處理。

7. 實驗完畢用洗(xǐ)手液清(qīng)洗雙(shuāng)手。

五，常見(jiàn)問題

1. 腺病毒(dú)載(zǎi)體(tǐ)有(yǒu)幾(jī)代，需要(yào)怎(zěn)樣選擇？

第一代腺病毒(dú)載(zǎi)體(tǐ)：E1/E3 基因缺失(shī)的腺(xiàn)病(bìng)毒載(zǎi)體稱為第一代腺(xiàn)病毒(dú)載體(tǐ)；

第(dì)二(èr)代腺病毒(dú)載體：E2A/E4 基因缺(quē)失的腺病毒載(zǎi)體被稱為第(dì)二(èr)代(dài)腺病毒載體，產生(shēng)的(dí)免疫(yì)原性(xìng)較低(dī)，載(zǎi)體容(róng)量和安(ān)全(quán)性方麵(miàn)均提高(gāo)，但病毒包裝難度和(hé)出毒(dú)滴度嚴(yán)重(zhòng)下(xià)降(jiàng)，應用受(shòu)限(xiàn)。

第三代腺(xiàn)病毒載體：第三(sān)代載體(tǐ)缺(quē)失(shī)了全(quán)部的(dí)或大部分(fēn)腺(xiàn)病(bìng)毒(dú)基(jī)因，僅保(bǎo)留了(liǎo)兩(liǎng)端(duān) ITR 和(hé)包裝信(xìn)號。包裝(zhuāng)容量高達(dá) 35kb，免(miǎn)疫(yì)原性極低，載(zǎi)體中(zhōng)引(yǐn)入(rù)核基(jī)質附(fù)著(zhuó)區(qū)基(jī)因用於(yú)外源(yuán)基因長期(qī)表(biǎo)達(dá)並(bìng)增加了(liǎo)載體的穩定性(xìng)。但(dàn)第三代載體係統(tǒng)需要(yào)腺病毒(dú)突(tū)變體作為輔助病(bìng)毒。

目前，第(dì)一代腺(xiàn)病(bìng)毒載(zǎi)體仍是(shì)科研(yán)和(hé)臨床應用最(zuì)為廣(guǎng)泛的(dí)腺(xiàn)病毒載(zǎi)體，因此更為(wéi)推薦(jiàn)。

2. 腺病毒(dú)的(dí)兩種(zhǒng)包(bāo)裝(zhuāng)係(xì)統(tǒng)怎(zěn)麼(mó)選擇？

需要根(gēn)據(jù)自己(jǐ)實(shí)驗(yàn)室(shì)的經(jīng)驗以及需求(qiú)進(jìn)行選(xuǎn)擇(zé)。

（1）AdEasy 係統(tǒng)：操(cāo)作步驟相對(duì)可(kě)控，AdEasy 係(xì)統得(dé)到的病毒(dú)滴度(dù)相對(duì)較高。AdEasy 係(xì)統(tǒng)是較(jiào)常用的係(xì)統，在 BJ5183 感(gǎn)受態中完(wán)成(chéng)環(huán)狀腺(xiàn)病(bìng)毒基因(yīn)組的重組，將(jiāng)重(zhòng)組腺病毒(dú)基因(yīn)組(zǔ)經 Pac I 酶(méi)切(qiē)綫性化(huà)後(hòu)轉染(rǎn) 293A 細胞。但(dàn)重組腺(xiàn)病毒基因組的陽性(xìng)率比(bǐ)較低，需要挑選大(dà)量的克隆進行驗(yàn)證(zhèng)。

（2）AdMax 係統(tǒng)：是直接將(jiāng)穿(chuān)梭質粒和骨架(jià)質粒導入(rù)到包裝細胞(bāo) 293A 中，重(zhòng)組過(guò)程(chéng)不可控，中(zhōng)間(jiān)無法(fǎ)進行篩選(xuǎn)，所以重組假陽性較高，篩選(xuǎn)陽(yáng)性結果(guǒ)的難度較(jiào) AdEasy 係統高很多。 但(dàn) AdMax 包裝(zhuāng)係(xì)統流(liú)程更簡(jiǎn)便(biàn)易操(cāo)作(zuò)，適(shì)合(hé)新(xīn)手(shǒu)研(yán)究(jiū)人員(yuán)。

3. 腺(xiàn)病毒(dú)純化(huà)的目的是什麼？

純(chún)化(huà)後(hòu)的(dí)腺(xiàn)病毒(dú)可以去(qù)除(chú)缺損(sǔn)的(dí)病毒(dú)顆(kē)粒，細胞毒(dú)素(sù)，細胞(bāo)培(péi)養基，以及細胞碎片等(děng)雜(zá)質。純化腺病毒(dú)免(miǎn)疫原(yuán)性(xìng)較低，更適(shì)合(hé)做動(dòng)物實驗(yàn)。

4. 腺病(bìng)毒感(gǎn)染(rǎn)毒斑(bān)和(hé)細(xì)胞(bāo)聚集(jí)怎(zěn)麼(mó)進行區(qū)分(fēn)？

鏡(jìng)下觀察發(fā)現類(lèi)似病(bìng)毒(dú)空(kōng)斑或者細胞聚集(jí)的(dí)現象(xiàng)時，應(yīng)繼(jì)續培養(yǎng) 1-3 天，觀(guān)察(chá)聚(jù)集區(qū)域(yù)是(shì)否擴(kuò)散，若持續(xù)擴散一般為病毒(dú)毒斑(bān)，若聚集(jí)區域保持(chí)不變，則一(yī)般(bān)為(wéi)細胞(bāo)聚集現象(xiàng)。