材(cái)料(liào)與儀(yí)器(qì)

RNA
PBS 細胞裂解液(yè) SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 異(yì)戊醇 無(wú)水乙醇
離(lí)心(xīn)機(jī) 培(péi)養(yǎng)箱

步驟

1. 對於(yú)單層培(péi)奍細(xì)胞
（1）每10 cm 培養皿培養(yǎng)的細(xì)胞，用冰冷PBS洗(xǐ)滌(dí)3次。
（2）每次1 ml 然(rán)後用(yòng)小體積(jī)PBS刮下細胞(bāo)，轉(zhuǎn)移至冰(bīng)浴的離心管中(zhōng)。
（3）300 g 離(lí)心5 min，棄上清(qīng)，繼(jì)續(xù)冰(bīng)浴。

2. 對於懸浮培養細(xì)胞
（1）300 g 離(lí)心5 min，棄上請。
（2）細(xì)胞以1/2原體(tǐ)積的(dí)冰冷重懸(xuán)，再離心後(hòu)棄(qì)上清(qīng)。

3. 重(zhòng)懸(xuán)細(xì)胞(bāo)於(yú)375 μl 冰(bīng)冷的細胞裂解緩衝(chōng)液(yè)，並置冰浴5 min。
4. 於4℃在微(wēi)量離(lí)心(xīn)機中離心(xīn)2 min，將(jiāng)上清移至(zhì)一個潔淨的(dí)已(yǐ)加有5 μl 20%SDS的(dí)管(guǎn)中(zhōng)，立即在旋(xuán)渦(wō)混合(hé)器(qì)上(shàng)振蕩。

5. 加(jiā)入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白(bái)酶K，37℃溫育(yù)15 min。

6. 加(jiā)入400 μl 酚/氯(lǜ)仿(fǎng)/異戊(wù)醇抽提，在(zài)旋(xuán)渦(wō)混合(hé)器上振(zhèn)蕩(dàng)用(yòng)微(wēi)量離(lí)心機離心，上清(qīng)移(yí)至幹淨的離心管中，重復(fù)抽(chōu)提(tí)1遍。
7. 再(zài)以400 μl 氯(lǜ)仿(fǎng)/異(yì)戊醇(chún)抽棰(chuí)，上層水(shuǐ)相轉移至幹(gān)淨的(dí)離(lí)心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)。
8. 加入(rù)40 μl 3 mol/l 乙酸(suān)鈉緩衝液(yè)（pH7.5），再(zài)加(jiā)無(wú)水(shuǐ)乙(yǐ)醇，混(hùn)匀後(hòu)在(zài)幹(gān)冰(bīng)/乙醇(chún)中沉(chén)澱(diàn)15~30 min或-20℃過夜。

9. 用微(wēi)量離心機(jī)4℃離心15 min 加(jiā)人(rén)1 ml 75%乙醇(chún)/25% 0.1 mol/l乙酸鈉（pH5.2）冼(xiǎn)滌(dí)沉澱。
10. 幹(gān)燥後用(yòng)100 μl 處理過的(dí)水重(zhòng)溶沉(chén)澱，取10 μl RNA稀釋於(yú)1 ml 水中，測A280和A260，其(qí)與的(dí)RNA可(kě)在-70℃貯存(cún)。

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